GFP标记的4种链格孢菌对枣树的侵染研究

田红雨，史晓梦，张 敏，王亚聪，张书蔚，冉隆贤

（河北农业大学 a.林学院；b.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000）

枣Ziziphus jujubaMill.属于鼠李科枣属植物，在我国最早栽培于7 000年前的黄河中下游地区，是我国最古老的果树之一[1-2]。枣树具有抗逆性强、经济效益和生态效益均显著等特点，在我国的栽培十分广泛，我国的枣树栽培面积和枣果产量均占世界的98%以上[3-6]。枣果是一种药食同源的果品，枣果含有多种氨基酸、维生素及丰富的矿质元素，又有养血安神、补中益气、强身健脾等功效，具有很高的营养与药用保健价值[4-5,7-8]。

枣缩果病是枣树生产中危害极为严重的病害之一，普遍发生于我国各主要产枣区，枣果受害后变色干缩，果肉呈海绵状坏死，提前脱落，常导致大面积减产甚至绝收[9]。目前生产上对此病害的防治效果一直不够理想，因为对其病原菌的侵入时间和侵入途径等尚不明确。有关研究结果表明，枣缩果病菌在枣树中具有长期潜伏侵染的特性[10]，不同地区的发病时期又存在差异性，侵染时间最早可发生于5月下旬，7—8月为发病初期，8月中下旬至9月上旬为发病高峰期[11-13]，病原菌主要从水孔、气孔及果洼通过风雨传播侵入枣果，也可从花、叶片侵入枣树体内[11,14]。有关研究者曾报道，枣缩果病的病原菌种类繁多，目前学术界对此仍存在很大的争议。吴婷等[15]认为，真菌和细菌共同导致了枣缩果病的发生。韩党悦[16]和许阳[17]都认为，枣缩果病的初侵染病原是互隔链格孢菌Alternaria alternata。这一研究结果解决了长期以来由于病原不清而导致的防治困难等问题，有助于扭转40 多年来枣缩果病病原混杂不清的局面，为生产中枣缩果病的有效防治提供了技术支撑。何丽等[18]对新疆病果的病原菌进行常规分离后，选取了有代表性的菌株进行了致病性的检测和鉴定，也明确了链格孢菌是枣缩果病的病原菌。

链格孢属Alternaria真菌广泛分布于世界各地，该属真菌种类繁多，寄主范围广，适应性强，目前已经发现的大约有500 种，可引起包括玉米、小麦、马铃薯、番茄和苹果、梨等几十种栽培植物的病害，给农业生产造成了巨大损失[19-20]。相关研究结果表明，苹果斑点落叶病、梨黑斑病、马铃薯早疫病和番茄黑斑病的病原菌都是链格孢属真菌[21-27]，苹果、梨等果树和马铃薯、番茄等农作物经常栽培于枣园附近，但侵染这些植物的链格孢菌是否还可侵染枣树，引起枣树果实病害的发生，对此问题的研究尚未见诸报道。为此，本研究以苹果斑点落叶病菌A.mali、梨黑斑病菌A.kikuchiana、马铃薯早疫病菌A.solani和番茄黑斑病菌A.alternata为研究对象，对其进行绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标记，并对成功标记的菌株在枣果上进行致病性检测，以进一步探明枣缩果病初侵染链格孢菌的来源，并通过在枣树花期喷雾接种GFP标记的4种链格孢菌，进一步探究其在枣树上的侵染途径，从而为更有效地防治枣缩果病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株：苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌和马铃薯早疫病菌（分别编号为ZN01、ZN02 与ZN03）均由河北农业大学植物保护学院曹克强教授和朱杰华教授提供；GFP 标记的互隔链格孢菌（编号为CN193）和番茄黑斑病菌（编号为ZNXR）、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens gfp基因表达载体质粒，均由河北农业大学林木病理研究室提供。

试剂和培养基：潮霉素B、卡那霉素、利福平、氨苄青霉素、链霉素的浓度分别为10、50、20、100、100 mg·mL-1，乙酰丁香酮（AS） 0.2 mg·mL-1；以IM 为培养基[28]，以LB 为液体培养基[29]。

供试植物：枣树，栽培于河北农业大学苗圃。

1.2 方 法

1.2.1 4 种链格孢菌对潮霉素B 的敏感性的测定

采用生长速率法分别测定供试的4 种链格孢菌对潮霉素B 的敏感性。分别将ZN01、ZN02、ZN03 和ZN-XR 这4 种链格孢菌置于PDA 培养基上，于25 ℃黑暗条件下培养7 d，然后用直径为 7 mm 的打孔器在所培养菌株的菌落边缘打取菌碟，分别置于含有浓度依次为5、10、20、50 和100 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培养基上，以不加潮霉素B 培养的菌落作为对照，每个处理各设3 次重复。当对照菌落的直径至少长到30 mm 时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度潮霉素B 处理下4 种链格孢菌菌丝生长的抑制率[30]。将抑菌率（%）转化为几率值（y），将药剂浓度转化为对数（x），求出毒力回归方程y=a+bx，根据此方程计算有效抑制浓度EC50值（μg·mL-1）及相关系数（r），并根据EC50值分析4 种链格孢菌对潮霉素B 的敏感性。

菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(处理菌落直径)]×100%。

1.2.2 4 种链格孢菌的GFP 标记

取农杆菌10 μg 加入到20 mL 的LB 液体培养基（含 有20 μg·mL-1的利福平、50 μg·mL-1的卡那霉素和100 μg·mL-1的链霉素）中，在28 ℃、220 r·min-1的摇床中培养24 h 后取出，吸取1 mL转移至1.5 mL 的离心管内，以5 000 r·min-1的转速离心2 min，弃上清液，加入1 mL 的IM，吹打使其沉淀悬浮，再次以5 000 r·min-1的转速离心 2 min，弃上清液后加入1 mL 的IM，再次吹打使其沉淀悬浮，然后转移至9 mL 的IM 中，分别加入10 μL 的卡那霉素、链霉素、AS，置于摇床上，于28 ℃的温度条件下以80 r·min-1的转速培养4 h后取出，加入无菌生理盐水将光密度值（OD600）调节至0.2 ～0.3。将4 种链格孢菌的分生孢子悬浮液（1×106个·mL-1）置于4 ℃冰箱内低温处理 6 h，以提高转化率，然后分别加入等体积的上述农杆菌菌液混合，各取200 μL 均匀涂抹于划线的无菌滤纸条上，再置于IM 固体培养基上，于 25 ℃的黑暗中培养36 h 后将滤纸条取出并翻转置于含有5 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培养基中继续培养。

1.2.3 GFP 标记菌株的稳定性检测

为了测定转化子的遗传稳定性，每种菌各随机挑选8 个转化子，将其接种到不加潮霉素B 的PDA 培养基中，于25 ℃的黑暗条件下培养7 d 后，挑取新长出的菌丝将其转接到PDA 培养基上继续培养。按上述方法继代培养5 代，挑取4 种菌的初代和第5 代转化子的菌丝，将其置于荧光显微镜下观察并照相。为了测定其生长的稳定性，将 4 种菌的第5 代转化子和野生型菌株分别置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上在25 ℃的黑暗条件下培养，观察菌落生长情况并测量其直径。

1.2.4 GFP 标记的4 种链格孢菌侵染枣果的测定

将GFP 标记的4 种链格孢菌、枣缩果病互隔链格孢菌（编号为CN193::gfp）和空白的PDA培养基分别制备成4 mm×4 mm 的菌碟，采用刺伤接种的方法分别将其接种在健康的枣果上，每组各设8 个点，每个处理各设6 组，分别以接种CN193::gfp和空白PDA 作为对照。将接种后的枣果用保鲜膜包裹好，3 d 后取下保鲜膜，7 d 后观察其发病情况并计算发病率，然后将发病枣果带回实验室，用70%的酒精消毒30 s，用无菌水冲洗3～ 4 次后取其病健交界处的组织，将其置于含有 10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上，于25 ℃的黑暗条件下培养，待其有菌丝长出后挑取各处理的菌丝，放在荧光显微镜下观察其是否有荧光。

1.2.5 GFP 标记的4 种链格孢菌侵染枣花的测定

在枣树花期于试验地选择未发生枣缩果病的枣树，将GFP 标记的4 种链格孢菌和CN193::gfp分别置于PDA 培养基上于25 ℃黑暗条件下培养7 d 后，用无菌水分别配制成浓度为105个·mL-1的分生孢子悬浮液以备用。以接种经GFP 标记的 4 种链格孢菌为试验组，以接种CN193::gfp为对照组，每组各选取3 株枣树，每株枣树各选2 个枝条，在无风雨的天气且日照较弱的下午对枣花喷雾接种分生孢子悬浮液，每隔5 d 喷1 次，共喷3 次。待枣果长出并发病后采回，用70%的酒精消毒30 s， 用无菌水冲洗3 ～4 次后取病健交界处的组织，将其置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上，于25 ℃的黑暗条件下培养，待其有菌落长出后挑取菌丝，在荧光显微镜下观察其是否有荧光。

1.3 统计方法

采用SPSS 17.0 软件用单因素方差分析法进行数据统计与分析，并用最小显著差异法（LSD）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 4 种链格孢菌对潮霉素B 的敏感性

潮霉素B 的毒力回归方程和有效中浓度EC50值见表1。苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌对潮霉素B 的敏感程度有差别，但潮霉素B 的处理浓度与抑制效果间呈正相关，各处理的相关系数均在0.91 以上，说明这4 种链格孢菌对潮霉素B 均敏感，因此可使用以潮霉素B 标记的gfp基因对这4 种链格孢菌进行标记。

2.2 GFP 标记菌株的稳定性

分别挑取4 种链格孢菌的初代和第5 代转化子的菌丝置于荧光显微镜400 倍下观察，均可观察到明显的荧光，观察结果如图1 ～4 所示。从图1 ～4中可以看出，第5 代与初代转化子的荧光强度均无差异。培养5 d 后发现，4 种链格孢菌的第5 代转化子在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上均可正常生长，且其菌落直径的大小与野生型菌株间均无差异。以上结果表明，经GFP 标记的4 种链格孢菌其遗传转化后的特征明显且稳定。

表1 潮霉素B 的毒力回归方程和有效中浓度Table 1 Virulence regression equations and median effective concentrations of hygromycin B

图1 ZN01::gfp 继代培养5 代后与初代培养的菌丝荧光比较Fig.1 Fluorescence comparison of hyphae from ZN01::gfp in primary culture and the fifth subculture

图2 ZN02::gfp 继代培养5 代后与初代培养的菌丝荧光比较Fig.2 Fluorescence comparison of hyphae from ZN02::gfp in primary culture and the fifth subculture

图3 ZN03::gfp 继代培养5 代后与初代培养的菌丝荧光比较Fig.3 Fluorescence comparison of hyphae from ZN03::gfp in primary culture and the fifth subculture

图4 ZN-XR::gfp 继代培养5 代后与初代培养的菌丝荧光比较Fig.4 Fluorescence comparison of hyphae from ZN-XR::gfp in primary culture and the fifth subculture

2.3 GFP 标记的4 种链格孢菌对枣果的侵染

分别以GFP 标记的4 种链格孢菌、枣缩果病互隔链格孢菌（CN193::gfp）和空白的PDA 培养基对枣果进行刺伤接种后发现，接种CN193::gfp和4 种链格孢菌的枣果其后期均发病，接种CN193::gfp和ZN01、ZN02、ZN03、ZN-XR 的枣果其发病率分别为93.8%与75.0%、87.5%、81.3%、83.3%，且各处理间无显著差异（P＞0.05），而空白对照的未发病（图5）。接种4 种链格孢菌的枣果均发病且均有病斑出现，其病斑均呈褐色凹陷状，果肉呈土黄色、海绵状坏死，提前脱落 （图6 A—D），此症状与接种CN193::gfp的枣果的发病症状（图6 E）相同。

图5 以不同链格孢菌刺伤接种后枣果的发病率Fig.5 Disease incidences of jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

图6 以不同链格孢菌刺伤接种后枣果的发病症状Fig.6 Symptoms of diseased jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

对刺伤接种CN193::gfp和4 种菌株后的发病枣果进行病组织分离，所有病组织在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上均有菌落长出。分别挑取菌丝放在荧光显微镜（400 倍）下观察，均可观察到荧光，观察结果如图7 所示。这一观察结果进一步表明，以苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌刺伤接种均可使枣果发病，供试菌株对枣树均有致病性。

2.4 GFP 标记的4 种链格孢菌对枣花的侵染

将采回的花期喷雾处理枝条上的发病枣果置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培养基上分离培养后，以4 种链格孢菌和CN193::gfp接种处理的病果上均有菌落长出，分别挑取各处理的菌丝放在荧光显微镜（400 倍）下观察，均可观察到荧光，观察结果如图8 所示。图8 表明，苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均能通过枣花侵入枣树。

图7 以不同链格孢菌刺伤接种后从枣果病组织中分离出的菌丝Fig.7 Hyphae isolated from diseased tissues in jujube fruit inoculated with different Alternaria species through stabbing

图8 从花期喷雾接种后的发病枣果中分离出的菌丝Fig.8 Hyphae isolated from diseased jujube fruits inoculated through spraying at florescence

3 结论与讨论

3.1 讨 论

目前，农杆菌介导的绿色荧光蛋白标记技术在许多重要的病原真菌侵染寄主过程中都得到了成功的应用[31-37]。本研究采用张敏对枣缩果病菌（CN193）的GFP 标记方法[38]试验发现，苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌对潮霉素B 均敏感，因此，应用农杆菌介导的遗传转化法，成功地将潮霉素B 标记的gfp基因转入到了这4 种链格孢菌中，且转化子的稳定性良好，可以有效避免田间分离回收病原菌时杂菌的干扰，并且与筛选抗药性突变体的方法相比，在对病原菌的研究过程中具有更简便、直观、稳定的特点，今后可利用此方法进一步研究枣缩果病菌的侵染规律和侵染动态。

本研究采用枣果刺伤接种的方法，检测GFP标记的4 种链格孢菌对枣树的致病性，结果发现，它们均可使枣果产生与接种枣缩果互隔链格孢菌CN193::gfp相同的发病症状，从接种了4 种链格孢菌菌株的发病枣果中分离培养长出的菌丝，在荧光显微镜下均可观察到荧光，说明苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均可使枣果发病，对枣树均有致病性，这一研究结果与张敏等[39]对枣缩果病互隔链格孢菌潜在寄主的研究结果一致。因此，在枣园附近应避免种植马铃薯、番茄、苹果、梨及其它易被链格孢菌侵染的植物，应做好周围感病植物的病害管理和园区的综合防治工作。今后还需进一步对其它链格孢属真菌的致病性进行研究，分析其与枣缩果病互隔链格孢菌的同源性，从而为进一步明确枣缩果病的初侵染病原提供更加可靠的依据。

枣缩果病菌最初侵入枣树的时期尚不明确，因此，本研究进一步探究了供试GFP 标记的4 种链格孢菌对枣树的侵染途径，将其在枣树花期喷雾接种，待处理枝条上的枣果长出并发病后带回实验室分离，结果发现，其病组织分离培养后长出的菌丝在荧光显微镜下均能观察到荧光，说明这4 种链格孢菌均能在枣树花期通过枣花侵入枣树，许阳[17]、赵乐等[40]、张敏[38]也都研究证明了枣缩果病互隔链格孢菌在花期即能侵入枣树，且王森等[41]在观察不同地区不同类型枣吊的开花期后发现，枣树盛花期较长，为1 ～2 个月，所以必须重视在枣树花期对枣缩果病的防治工作，从而更加有效地避免这类病原菌对枣树的危害。

3.2 结 论

本研究采用农杆菌介导遗传转化法获得了GFP 标记的苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌和番茄黑斑病菌，在枣缩果病的研究中为开展病原菌对寄主的侵染研究提供了更加简便有效的方法，同时证实了这4 种非枣属植物寄主上的链格孢属真菌对枣树均有致病性，且在花期和幼果期均可以侵入枣树，由此推测，这 4 种链格孢菌也都有可能成为枣缩果病的潜在病原菌，这一研究扩大了枣缩果病初侵染病原的研究范围，并对枣园规划和管理具有一定的指导意义。