EMS诱变花生珍珠红1号创制优良新种质

许 燕 谢永平 郑楚群 陈育华 陈肇聪 李 辉

(汕头市农业科学研究所,广东 汕头 515021)

花生(Arachis hypogaeaL.)是我国主要的油料作物和重要的经济作物。2016-2017年,我国花生年播种面积稳定在440 万hm2以上,年总产量1 700 万t 左右,约占油料作物总产量的49%[1]。近些年,随着社会经济发展和人民生活水平提高,市场对优质花生的需求越来越大,而我国目前大面积推广的主要花生品种品质较差[2],因此,高产、优质、专用型已成为花生育种的重要目标[2-3]。

化学诱变技术具有效果好、稳定快等优点,是一种有效的育种手段[4-5]；其诱变产生的突变体遗传背景相似,多为单基因突变,是研究基因功能的理想材料。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)被认为是应用最好的诱变剂,已成功应用于水稻[6-7]、小麦[8-11]、玉米[12-13]、大豆[14-16]和油菜[17-18]等多种作物的种质创新和品种培育。在花生上,前人采用EMS 处理花生种子[19-23]、带胚子叶[24]、果针[25]和直接注入花器[26-29]等方法进行诱变研究,已创制出一大批新种质,先后育成了Co2[19]、鲁花12[25]、花育40[29]和汕油诱1号[30]等优良新品种。为更快培育出更多高产优质花生新品种,本研究选用优质高产抗病花生品种珍珠红1号[31]为材料,采用EMS 溶液浸泡干种子的方法,分析不同浓度EMS 的诱变效应,并运用田间调查、室内考种、近红外光谱品质分析、简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记检测等手段对后代材料进行鉴定、筛选,以期获得高产、优质、综合性状优良的突变材料及其他特异材料,为花生优良新品种培育和基因功能学研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

花生品种珍珠红1号的干种子,由汕头市农业科学研究所保存。珍珠红1号为珍珠豆型,种皮深红色,油分含量52.86%,蛋白质含量28.52%,白藜芦醇含量较高(花生仁和花生衣含量分别达9.0、9.2 μg·g-1),2002年通过广东省农作物品种审定[31]。诱变剂EMS,美国Sigma 公司。

1.2 试验方法

EMS诱变处理在汕头市农业科学研究所实验室进行,M1～M3种植于汕头市农业科学研究所本部试验基地,M4～M5种植于汕头市农业科学研究所潮州市官塘试验基地。

1.2.1 EMS诱变和M1处理 2016年3月下旬,用0.01 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 值7.0)配制EMS 浓度分别为0(对照,CK)、0.8%、1.0%、1.2%的溶液(分别记作处理1、2、3、4),现配现用,再将健康饱满的种子倒入其中,在黑暗环境下浸泡10 h,然后用大量自来水漂洗4 遍,晾干后播种于装有湿润营养土(园土∶椰糠＝1∶1,v/v)的育苗盘中,每穴1 粒,放于简易塑料大棚内精心培养,并调查苗开始出土所需时间,播种3 周后统计出苗率和相对出苗率。每个处理浸泡50 粒种子,3 次重复。按照公式计算出苗率和相对出苗率：

出苗率＝出苗数/播种的种子数×100%；

相对出苗率＝处理出苗率/对照出苗率×100%。

随后将对照组63 株苗(各重复均21 株)和其他处理的全部苗(处理2、3、4 分别为85、41、39 株)移栽到大田(7 行区,行株距14 cm×23 cm),按常规方法进行田间管理,调查植株生长状况及变异情况。收获时,统计各处理存活植株总数,对照组每株随机留取1 个荚果,其他处理每株随机留取10 个荚果(不足10 个果的全留),变异材料按突变类型归类。

1.2.2 M2和M3的调查筛选 2016年秋季,将上一代留存的各个荚果随机取1 粒健康、未发芽的籽仁播种于大田,处理1(CK)、2、3、4 分别播种57、557、201、220 粒种子,7 行区,行株距14 cm×23 cm,单粒穴播。调查处理2、3、4 花生株高、叶片、荚果等性状的变异情况。收获时,统计各处理存活植株数；对照组混收,其他处理单株收获变异株和优株；获得的单株按来源分组进行编号,例如从处理2 的第Ⅰ重复中筛选获得的第3 个单株为诱珍珠红1号2Ⅰ/3。

2017年春季,设置3 组对照,各单株种成株系进行鉴定,筛选优、异株系；稳定或基本稳定的株系选择典型株混收成品系；种皮颜色发生分离的株系,按种皮色分类混收。种植方式与M2相同。

1.2.3 M4的筛选与ISSR 分子检测 2017年秋季,以珍珠红1号作为对照,对M4突变系进行品系鉴定,小区按顺序排列。5 行区,行株距20 cm×23 cm,双粒穴播。分别测量5 个典型株的主茎高,调查抗病性、种皮颜色等性状,称量小区干荚果产量,折算为相同面积产量后计算增产率；随机取250 g 成熟饱满的干荚果剥取籽仁,计算出仁率,筛选优良突变系。优良突变系和对照各选取20 个典型双仁果,按照姜慧芳等[32]的方法测量荚果长和荚果宽。

委托西南大学利用ISSR 分子标记技术对一部分M4突变系进行检测。采用CTAB 法提取突变系和对照珍珠红1号幼嫩叶片基因组总DNA,用筛选到的多态性好、扩增条带较多的12 条引物(表1)进行PCR扩增。PCR 反应体系：1×Buffer 缓冲液,引物0.5 μmol·L-1,dNTPs 0.2 mmol·L-1,Taq酶[宝生物工程(大连)有限公司]1.0 U,模板DNA 1.0 ng·μL-1,加灭菌超纯水补足至总体积25 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s；50℃复性1 min,72℃延伸2 min,40 个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物用3 μL 上样缓冲液混匀后,经1.5%琼脂糖凝胶电泳1.5 h,Goldview 染色后,在Gel Doc XR＋凝胶成像系统(美国Bio-Rad 公司)中观察并获取图像。

表1 12 条ISSR 引物及其序列Table 1 12 ISSR primers and their sequences

1.2.4 M5的鉴定与筛选 2018年春季,将9 个优良突变系与对照珍珠红1号进行品比试验,重点考查抗病性、抗倒性、单株结果数、百果重、百仁重、出仁率、产量、品质等性状,进一步筛选突变系。随机区组排列,3次重复,小区面积6.67 m2,种植方式与M4相同。

花生生育期间,调查全区青枯病发病株数,计算病株率。收获前一周左右,各材料随机取5 个典型株,按照《广东省农作物品种试验办法》中锈病的病级标准：无肉眼可见的孢子堆为0 级,孢子堆面积占整片叶面积的5%以下为1 级,孢子堆面积占整片叶面积的6%～10%为3 级,孢子堆面积占整片叶面积的11%～20%为5 级,孢子堆面积占整片叶面积的21%～50%为7 级,孢子堆面积占整片叶面积的51%以上为9 级；叶斑病的病级标准：无病斑为0 级,叶面有1～5 个病斑为1 级,叶面有6～10 个病斑为3 级,叶面有11～20 个病斑或病斑面积占整片叶面积25%以下为5 级,病斑面积占整片叶面积26%～50%为7 级,植株发病严重、病斑面积占整片叶面积51%以上、叶片枯萎下垂为9 级。每株从顶叶开始向下调查10 片叶的锈病、叶斑病级别,并计算其病情指数,病情指数＝∑(病级数×该病级叶片数)/(调查总叶数×9)×100,同时调查单株结果数。按照姜慧芳等[32]的方法考查百果重、百仁重和出仁率,均取样3 次。

收获后约3 个月剥取籽仁,取样3 次,运用近红外光谱分析法对籽仁的粗脂肪、粗蛋白、脂肪酸等成分进行检测,检测仪器为DA 7250 近红外分析仪(瑞典Perten 公司)。

1.2.5 数据分析 利用SPSS 16.0 软件进行数据统计分析。M4荚果宽的数据不满足方差齐性,进行Welch’s 方差分析,多重比较采用Games-Howell 法；其余有关数据进行方差分析,多重比较采用Ducan’s 法。

凝胶图像用Quantity One 4.3.1 软件进行分析,强反应带记“1”,弱反应带重复出现记“1”,弱反应带出现但不重复记“0”,无带记“0”,计算其扩增带总数和特异带总数,并将0、1 矩阵图(∗.TXT 格式)输入计算机。数据采用NTSYSpc-2.1e 软件处理,相似性系数采用 Dice 系数,UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmatic Average)聚类分析得到聚类关系图。相似性系数计算公式如下：

Sij＝2Nij/(Ni＋Nj)

式中,Sij为材料i和j的相似系数；Nij是材料i和j共有的条带数；Ni和Nj分别是i和j各自的条带数。

2 结果与分析

2.1 EMS 处理对种子出苗的影响及M1植株的田间表现

由表2可知,与CK 相比,各EMS 处理对珍珠红1号的出苗情况都有极显著影响(P＜0.01),且随着EMS浓度的增大,苗开始出土所需时间增加,出苗率降低。处理2 的花生出苗率和相对出苗率最接近50%；收获时存活72 个植株,占诱变处理种子数的48%,接近半致死。以半致死剂量为选择标准,花生珍珠红1号干种子诱变的适宜条件为0.8% EMS 处理10 h。

田间调查发现,与CK 相比,各EMS 处理均有少数M1植株出现表型突变,如矮化、分枝少、无分枝、叶小、叶型变、叶色变等；从整体上看,处理3 和处理4 的M1植株高度明显矮于CK。

表2 EMS 处理对珍珠红1号种子出苗的影响Table 2 Effects of EMS on seedling emergence of Zhenzhuhong 1

2.2 M2的调查与筛选

调查发现,处理2、3、4 的M2群体中均存在变异株,主要突变表型为植株矮化、植株增高、叶小、分枝少、不育、大果、小果和种皮变色等,而且部分变异株为多个性状发生突变。收获时,处理1(CK)、2、3、4 各存活32、317、105、80 株植株,存活率分别为56.14%、56.91%、52.24%、36.36%,其中处理2 和处理3 的存活率与CK相当。经过筛选,处理2、3、4 共获得93 个单株,其中变异株52 株；处理2 入选的植株和变异株数量均最多,且获得唯一一个种皮褐色的突变株(表3)。

表3 M2植株筛选结果Table 3 Selection results of M2plants

2.3 M3的鉴定与筛选

株系鉴定表明,处理2 有2 个矮化、叶小变异株不遗传,1 个果大变异株分离产生种皮浅红色的植株；处理3 有1 个分枝少变异株不遗传；处理4 有2 个矮化、分枝少变异株的分枝少突变性状不遗传,1 个矮化变异株分离产生种皮浅红色的植株；其余株系稳定或基本稳定。经过筛选,处理2、3、4 分别获得37、14、13 个品系。

2.4 M4的筛选与分子鉴定

由表4可知,M4中筛选获得9 个优良突变系,其干荚果产量和出仁率均高于珍珠红1号(CK),抗病性好于或相当于CK。其中,5 个突变系的主茎高极显著低于CK,8 个突变系的荚果长与CK 相比差异极显著,3 个突变系的荚果宽极显著小于CK,5 个突变系的种皮颜色异于CK。

表4 珍珠红1号和优良M4突变系的主要性状Table 4 Main characters of Zhenzhuhong 1 and its superior mutants

采用12 条ISSR 引物对突变系和珍珠红1号进行PCR 扩增,结果表明,9 个优良突变系均与珍珠红1号存在多条差异性条带,其中诱珍珠红1号4Ⅲ/3 的特异性标记最多,与珍珠红1号之间的差异性条带数目也最多,与其他材料的差异最明显。不同引物扩增的差异性条带数也存在较大的变化,引物924 扩增的差异性条带最多,达到38 条；引物873 则无明显的差异性条带(表5、表6)。从聚类分析结果看(图1),所有供试材料之间均能区分,其中诱珍珠红1号2Ⅲ/8 和诱珍珠红1号2Ⅲ/10 的相似性系数最高(0.939),诱珍珠红1号2Ⅲ/8 和诱珍珠红1号4Ⅲ/3 的相似性系数最低(0.490)。综上所述,筛选获得的优良突变系与野生型珍珠红1号在分子水平上均存在明显差异,说明与野生型相比,突变系发生了明显的遗传变异,且不同突变系之间也存在明显的遗传差异。

表5 优良突变系与珍珠红1号间的差异性扩增条带数目统计Table 5 The number of different bands among Zhenzhuhong 1 and its mutants

表6 特异性标记类型Table 6 The characteristic bands of some varieties

图1 10 份供试材料的UPGMA 聚类关系图Fig.1 The UPGMA cluster dendrogram of 10 test materials

2.5 M5的鉴定与筛选

品比试验鉴定表明,各试验材料的种皮颜色与上一代保持一致。7 个突变系的干荚果产量高于珍珠红1号(CK),其中诱珍珠红1号2Ⅰ/3 和诱珍珠红1号2Ⅲ/8 增产均达极显著水平,诱珍珠红1号2Ⅱ/19 增产显著；诱珍珠红1号4Ⅲ/3 等5 个突变系的出仁率极显著高于CK,诱珍珠红1号2Ⅲ/8 等4 个突变系的单株结果数极显著或显著高于CK,诱珍珠红1号2Ⅲ/9 的百果重极显著高于CK,诱珍珠红1号2Ⅱ/11的百仁重显著高于CK(表7)。

由表8可知,各突变系与珍珠红1号的主要品质性状存在一定差异。诱珍珠红1号2Ⅲ/10 的粗脂肪含量最高,达54.52%,较珍珠红1号(CK)提高1.50个百分点；诱珍珠红1号2Ⅱ/19 的粗脂肪含量最低,为50.89%,较CK 降低2.13 个百分点。诱珍珠红1号2Ⅰ/3 的粗蛋白含量最高,达28.18%,较CK 提高3.29 个百分点；诱珍珠红1号2Ⅲ/10 的粗蛋白含量最低,为23.94%,较CK 降低0.95 个百分点。诱珍珠红1号2Ⅰ/3 的油酸含量最高,达57.14%,较CK 提高8.90 个百分点；诱珍珠红1号4Ⅲ/3 的油酸含量最低,为42.73%,较CK 降低5.51 个百分点。诱珍珠红1号2Ⅲ/8 的亚油酸含量最高,达39.05%,较CK 提高3.28 个百分点；诱珍珠红1号2Ⅱ/19 的亚油酸含量最低,为29.59%,较CK 降低6.18 个百分点。诱珍珠红1号2 Ⅱ/19 的油酸/亚油酸比值(O/L)最高,达1.92,较CK 高0.57；诱珍珠红1号4Ⅲ/3 的O/L 最低,为1.10,较CK 低0.25。且各试验材料田间叶斑病、锈病和青枯病自然发病均较轻；除诱珍珠红1号2Ⅱ/11 和诱珍珠红1号2Ⅲ/9 抗倒性较差外,其他突变系抗倒性均强于或相当于CK。

表7 珍珠红1号与优良M5突变系的主要经济性状和产量表现Table 7 Main economic characters and yield of Zhenzhuhong 1 and its superior mutants

表8 珍珠红1号与优良M5突变系的主要品质性状与抗性Table 8 Main quality characters and resistance of Zhenzhuhong 1 and its superior mutants

由表7、表8 和图2可知,9 个突变系至少有一个性状明显优于珍珠红1号(CK),其中以下4 个突变系在产量、品质等方面均有较好的表现,且综合性状优良。诱珍珠红1号2Ⅱ/19：种皮深红色,干荚果产量较珍珠红1号(CK)增加18.03%,增产显著；出仁率68.5%,较CK 提高3.70 个百分点；油酸含量56.68%、O/L 1.92,分别较CK 提高8.44 个百分点和0.57。诱珍珠红1号2Ⅲ/8：种皮浅红色,干荚果产量较CK 增加26.78%,增产极显著；出仁率68.0%,较CK 提高3.20 个百分点；亚油酸含量39.05%,较CK 提高3.28个百分点。诱珍珠红1号2Ⅲ/10：种皮浅红色,干荚果产量较CK 增加10.93%,增产不显著；出仁率65.0%,与CK 相当；粗脂肪含量54.52%,较CK 提高1.50 个百分点。诱珍珠红1号3Ⅰ/8：种皮深红色,干荚果产量较CK 增加10.93%,增产不显著；出仁率66.9%,较CK 提高2.10 个百分点；油酸含量53.70%、O/L 1.71,分别较CK 提高5.46 个百分点和0.36。

图2 珍珠红1号和4 个优良M5突变系的荚果与籽仁Fig.2 Pod and seed of Zhenzhuhong 1 and 4 superior mutants

3 讨论

EMS 已成功应用于多种作物的种质创新和品种培育,但确定适宜诱变条件存在较大难度。浓度不够、诱变时间不足,诱发突变效果差；浓度过高、诱变时间过长,则试验材料损伤大。本研究结果表明,花生种子对不同浓度EMS诱变的响应存在显著差异,随着EMS浓度的增大,M1存活率下降,而不同浓度EMS诱变产生的M2突变表型差异不大。这与杨富军等[22]的研究结果一致。当EMS 浓度为0.8%时,M1存活率接近50%、存活植株最多,可供筛选的M2群体最大,所以入选的M2植株和变异株数量均最多。因此,0.8% EMS处理10 h 为花生珍珠红1号干种子适宜的诱变条件。

本研究筛选获得干荚果产量较野生型珍珠红1号提高10%以上的M5突变系5 个,增产率最高达26.78%,且3 个突变系增产达显著水平以上,其中3个突变系的出仁率极显著高于野生型,其理论仁产量也应高于野生型,表明EMS 处理花生可创造高产突变体,这与朱保葛等[20]、王传堂等[27]的研究结果一致。品质检测也证实,EMS 处理能诱发花生种子的内在品质发生变异。粗脂肪含量可提高1.50 个百分点或降低2.13 个百分点,粗蛋白含量可提高3.29 个百分点,油酸含量和亚油酸含量能分别提高8.90 个百分点和3.28 个百分点,O/L 可提高0.57。这与王传堂等[26]、王允等[28]的研究结果相似。但本研究中,粗脂肪含量的变幅较小,这可能与EMS 处理的起始材料基因型不同、品质筛选的群体不够大等因素有关。

本研究创制的9 个优良突变系均具有与野生型相比差异极显著的性状,且在产量、内在品质等方面,至少有一个性状明显优于野生型,其中包括种皮颜色异于野生型的突变系5 个,粗脂肪含量超过54%、亚油酸含量超过38%的突变系各3 个,油酸含量超过50%的突变系4 个。这些突变系的创制,为培育花生新品种和挖掘突变性状相关功能基因提供了优良的新种质。后续将开展多点比较试验,对苗头突变系的丰产性、适应性、抗病性、抗逆性和品质等性状进行更加全面的鉴定,力争育成新品种供生产应用。

4 结论

本研究结果表明,花生品种珍珠红1号干种子的适宜诱变条件为0.8% EMS 浸泡10 h；创制的9 个优良突变系与野生型珍珠红1号在表型上和分子水平上均存在明显差异,突变系与野生型相比发生了明显的遗传变异,不同突变系之间也存在明显的遗传差异。本研究创制的突变材料为花生遗传改良和功能基因研究提供了优良的新种质,诱变处理、后代鉴定选择等方法为花生EMS诱变育种研究提供了参考。

致谢：本试验ISSR 分子检测研究得到了西南大学园艺园林学院何桥、梁森林、蒋朋飞等老师和同学的帮助,在此一并表示感谢。