基于分子对接方法从临床药物和天然小分子化合物筛选潜在抗COVID-19病毒药物

李天一，于兰，张波

(石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832000)

新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，简称新冠肺炎)，是由COVID-19病毒感染导致的肺炎，传染性强，传播范围广，给社会带来巨大影响。目前临床常用西医治疗方案为抗微生物抗病毒药物为主糖皮质激素为辅，体外膜肺氧合治疗，重要脏器功能支持的对症治疗，中医药辩证治疗也取得了良好疗效[1]。但是尚无针对COVID-19的特异性药物的报道。

COVID-19是一种β冠状病毒，遗传物质是单股正链RNA，病毒颗粒呈圆形或椭圆形并有包膜，包膜上存在蛋白棘突。控制冠状病毒复制复合物活性的主蛋白酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用，Mpro与小核糖核酸病毒3C蛋白酶具有相似的切割位点特异性，这一酶通常称作3CL蛋白酶[2]。病毒复制及转录过程的两个关键多蛋白水解依赖Mpro及其同源酶，由于在冠状病毒复制和转录中的重要性，Mpro受到研究者的青睐[3]。部分研究者也关注其RNA聚合酶及解旋酶[4]。对从5名患者中获得的COVID-19进行全基因组测序已经证实COVID-19与SARS-CoV有85%的相似性且COVID-19与SARS-CoV病毒都通过病毒包膜上S蛋白与宿主细胞膜表面血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合[5]；这些巧合使得有关SARS-CoV的相关研究成果应用于COVID-19成为可能。对SARS-CoV药物研究主要集中在其S蛋白及其受体蛋白ACE2上[6]。

目前，COVID-19引发的肺炎疫情主要集中在防控方面，对于中轻度患者，肺部损伤容易受到救治，而对于肺损伤严重的重度患者，除肺组织实变外，还容易发生细菌感染，特别是金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌，最终引发肝、肾等多器官衰竭[7]。

相对2003年SARS-CoV病毒疫情的高爆发，虽然COVID-19引起的肺炎疫情受到了更好的控制，但特异性治疗药物缺乏仍是一大问题。洛匹那韦与利托那韦已被用于临床新冠肺炎的治疗中，但由于目前的治疗药物副作用大，寻找新的安全特异性抗新冠病毒药物迫在眉睫。本研究通过大数据分析，收集汇总临床抗逆转录病毒药物，抗金黄色葡萄球菌及抗肺炎链球菌药物，潜在天然小分子化合物，运用分子对接技术筛选特异性作用COVID-19病毒主蛋白酶Mpro及人受体ACE2的有关药物，为研究潜在抗COVID-19病毒药物和治疗疫情提供一定参考，为COVID-19疫苗研制争取时间。

1 材料与方法

1.1 药物信息来源

临床现有抗逆转录病毒药物，抗金黄色葡萄球菌药物，抗肺炎链球菌药物及天然小分子化合物来源于OMIM数据库(https://omim.org/)，CTD数据库(http://ctdbase.org/)及文献挖掘；化合物基本信息来源于Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 网络构建与分析

通过Cytoscape 3.6.1软件建立抗逆转录病毒药物-抗金黄色葡萄球菌药物-抗肺炎链球菌药物网络关系图，通过Network Analyzer插件分析抗新冠肺炎药物的接近向量中心度(closeness centrality)，利用Cytoscape软件寻找能够同时抗病毒及细菌的关键药物，用于下一步分子对接分析[8]。

1.3 分子对接与评分

COVID-19主蛋白酶Mpro晶体结构来自上海药物研究所及上海科技大学(PDB ID:6LU7)，使用SYBYL-X 2.0将筛选出的关键化合物与COVID-19主蛋白酶Mpro及关键受体ACE2进行虚拟分子对接及评分。将化合物模型通过Surflex-Dock(默认设置采样了统治弹性)对接到晶体结构蛋白质模型中，然后通过Surflex-Dock评分功能评分[9]，分数如下:对接>0.5被认为一般;对接的分数>4.0被认为有效;对接的分数>6.0被认为微摩尔级别有效[10]。综合得分为两项评分之和。

2 结果

2.1 抗逆转录病毒药物与关键蛋白的分子对接及评分

通过数据库得到抗逆转录病毒药物24个，分别与COVID-19主蛋白酶Mpro及关键受体ACE2进行分子对接及评分。与COVID-19主蛋白酶Mpro评分>6.0的有效药物，有奈非那韦、氨苯那韦、阿巴卡韦、洛匹那韦，分子对接结果如图1所示。与关键受体ACE2评分超过>6.0的有效药物见表2，有帕罗霉素、马拉维洛克、洛匹那韦、利托那韦、氨苯那韦、紫杉醇、阿昔洛韦，分子对接结果如图2。其中洛匹那韦与利托那韦已用于临床新冠肺炎治疗中，被本研究用作阳性对照。

表1 抗逆转录病毒药物与COVID-19主蛋白酶Mpro结合分数

表2 抗逆转录病毒药物与ACE2受体结合分数

图2 抗逆转录病毒药物与ACE2蛋白分子(绿色)对接(Score>4.0)

2.2 关键抗菌抗病毒药物筛选及其与关键蛋白的分子对接及评分

由于COVID-19病毒引发的肺炎易出现金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌感染。因此，通过数据库收集临床抗金黄色葡萄球菌药物10个及肺炎链球菌药物29个，具有抗逆转录病毒作用的药物345个，使用Cytoscape 3.6.1软件制作网络图，筛选出具有抗逆转录病毒、抗金黄色葡萄球菌、抗肺炎链球菌至少两种作用的关键药物分子19个见图3。将这19个药物分子进行分子对接及评分。与COVID-19 Mpro分子评分>6.0的有效药物见表3，奥司他韦、西司他丁和利福平，分子对接结果如图4所示。与关键受体ACE2评分>6.0的有效药物有西司他丁、泰拉万星见表4，分子对接结果如图5所示。

图3 抗逆转录病毒药物与抗金黄色葡菌、肺炎链球菌药物的网络关系图

表3 关键药物与COVID-19主蛋白酶Mpro结合分数

图4 关键药物与COVID-19主蛋白酶Mpro结合分数(Score>4.0)

表4 关键药物与ACE2受体结合分数

图5 关键药物与ACE2受体结合分数(Score>4.0)

2.3 具有抗菌抗病毒的临床天然小分子化合物与关键蛋白的分子对接及评分

基于文献挖掘技术找到较强抗病毒抗菌活性的几种天然小分子化合物紫草素、穿心莲内酯、黄芩素、姜黄素、金丝桃素、苦参素、没食子酸、木犀草素、秋水仙碱及莽草酸，并进行分子对接及评分。与COVID-19 Mpro评分>6.0的有效分子有紫草素、穿心莲内酯(表5)，分子对接结果如图6所示。与关键受体ACE2评分>6.0的有效分子有姜黄素、紫草素(表6)，分子对接结果如图7、图8所示。

表5 天然小分子化合物与COVID-19主蛋白酶Mpro结合分数

表6 天然小分子化合物与ACE2受体结合分数

图6 天然小分子化合物与COVID-19 Mpro结合分数(Score>4.0)

图7 天然小分子化合物与ACE2受体结合分数(Score>4.0)

图8 对Mpro和ACE2受体结合综合评分较高药物

3 讨论

新型冠状病毒COVID-19引发的肺炎是一种具有高传染性的疾病，整体死亡率为3.06%，远低于SARS-CoV，但传染性相当，基本传染数R0值在2.2到3.9之间[11-12]。疫情爆发造成人员死亡和经济停滞不前，所面临的严峻形势要求医疗界做出快速反应，但传统药物研发往往需要几个月甚至几年时间，不能快速应对爆发性疾病。肺炎疫情急需疫苗研发、中药防治、抗病毒药物等多个方面协同解决，寻找有效抗COVID-19病毒化合物迫在眉睫[13]。因此通过对现有药物和从天然小分子库中寻找到的具有抗病毒的小分子化合物进行研究，能够对病毒疫苗的研制工作带来一定的启示和指导作用。

Mpro酶在病毒生命周期中的重要性使其成为在抗冠状病毒药物研制中的重要靶点[14]。COVID-19 Mpro在此次疫情中也得到了重点关注。COVID-19病毒进入宿主细胞始于病毒表面S蛋白与细胞表面靶受体ACE2结合，在细胞膜融合后将病毒核衣壳传递到细胞内以进行复制[15]。以病毒表面的S蛋白为目标寻找靶向抗体，对病毒产生被动免疫，是目前研究人员的一种思路[16]，但是抗体需要经过严格的细胞和动物实验在人群中大规模测试以评估抗体的有效性和覆盖范围，该方案是一个缓慢而且复杂的过程[17]；另一种思路是不直接针对病毒糖蛋白，而是针对细胞膜表面的病毒受体蛋白作为靶点发挥中和作用，从而阻止病毒与其结合并进入细胞[18]。此次疫情爆发时间短，病毒无法突变产生新的宿主结合受体。宿主ACE2蛋白不会产生突变，因此不用担心药物分子的脱靶效应。与宿主ACE2蛋白特异性结合的药物分子具有非常好的临床应用前景。

COVID-19病毒是一种RNA病毒，本研究通过数据库寻找目前临床抗逆转录病毒药物，并与COVID-19病毒主蛋白酶Mpro及病毒作用受体ACE2进行分子对接评分。药物分子与蛋白质受体结合成构象时，结构越稳定，则能量越低，越容易发挥药效。本研究发现现有抗逆转录病毒药物对COVID-19主蛋白酶Mpro与ACE2受体均有良好作用的药物有马拉维洛克(5.5449，8.8294)、奈非那韦(8.3068，5.7834)、洛匹那韦(6.0549，7.6403)、氨苯那韦(6.6190，6.9776)、利托那韦(5.9897，7.3957)、帕罗霉素(3.97，9.1036)(图8)。洛匹那韦与利托那韦已作为国家卫建委发布的新冠肺炎防治方案中的治疗药物[1]，二者被报道是SARS Mpro特异性抑制剂[19]，洛匹那韦与利托那韦均能够和SARS、COVID-19 S蛋白竞争性结合ACE2受体[20]，阻断病毒进一步识别和侵入宿主过程。阿巴卡韦已被上海药物研究所公布可能对COVID-19有治疗作用。根据对接评分预测临床抗逆转录病毒药物可能有效的有马拉维洛克、奈非那韦和氨苯那韦。

随着感染的进行，患者易被金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌感染，导致病情加重，且广谱抗菌药和糖皮质激素似乎对肺炎疫情并没有特别好处[1,21]。因此本研究积极寻找具有抗病毒作用且能抑制肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌的药物进行分子对接并预测评分。最终发现与Mpro和ACE2受体都有良好作用的药物有西司他丁(7.2541，7.4961)、奥司他韦(7.5041，5.7571)。根据对接评分预测，与临床现有抗病毒药物洛匹那韦(6.0549，7.6403)与利托那韦(5.9897，7.3957)相比，潜在有效治疗药物为西司他丁和奥司他韦。临床常将亚胺培南与西司他丁联用，以保持俩者在体内的活性。

天然小分子化合物作为药物开发的前体和中药材中发挥治疗作用的关键。与COVID-19 Mpro和ACE2评分超过良好的小分子有紫草素(7.0913，6.6184)、姜黄素(5.4938，7.215)穿心莲内酯(6.0547，4.9049)。与洛匹那韦(6.0549，7.6403)与利托那韦(5.9897，7.3957)相比，潜在的有效治疗作用的小分子是紫草素和姜黄素。紫草素和姜黄素的抗炎抑菌抗病毒活性被广泛报道[22]。此外，穿心莲内酯对细菌性与病毒性上呼吸道感染有特殊疗效[23]。因此富含紫草素、姜黄素和穿心莲内酯的中药材可能在治疗新冠肺炎中起到重要作用。

ATC code (Anatomical Therapeutic Chemical)系统是一种根据药物作用的器官或系统以及如何作用而分配给药物的独特代码，是WHO对药品的官方分类系统。在ATC code分类系统中，活性物质被分为五个不同的等级。ATC代码第一级为一位字母，表示解剖学副族，第二级为两位数字，表示治疗学副族。第三级为一位字母，表示药理学副族。第四级为一位字母，表示化学副族。第五级为两位数字，表示化合物[24]。ATC code系统有助于减少不同国家和地区因语言和政策原因对药品名称产生的分歧，指导合理用药。ATC code系统可用于收集整理各种环境来源的药物使用统计数据[25]。本文收集37个临床药物，从解剖学上看，一级分类J属于全身使用的抗感染药，27种；从治疗学上看，二级分类05抗菌药(17种)和01抗病毒药物占大类(11种)。提示在外科手术辅助呼吸基础上，临床抗菌抗病毒药物依然是治疗COVID-2019的主要药物。

本文在当前对COVID-19研究有限的情况下，将重点放在可快速测试，有大量储备并且能够广泛应用的临床现有药物和天然小分子，通过分子对接的方式预测对COVID-19可能有治疗作用的药物，并提出几种潜在有效药物：1)除临床已经使用的洛匹那韦与利托那韦外[1]，阿巴卡韦、马拉维洛克、奈非那韦和氨苯那韦可能有效；2)除已发布于防治手册上的药物奥司他韦外，亚胺培南西司他丁(泰能)联合可能有效。亚胺培南西司他丁具有广谱抗菌活性，对细菌产生的β内酰胺酶高度稳定，在临床上用于严重细菌感染、多种细菌联合感染和耐药菌株感染，但由于广谱抗菌药物可能加重新冠肺炎，因此亚胺培南与西司他丁的使用应该经过更全面的研究与探索，从而决定是否具有抗新冠病毒的作用。3)富含天然小分子化合物紫草素、姜黄素及穿心莲内酯的中药方剂可能有效。对病毒Mpro和ACE2受体阻断药物的研究不仅能够治疗已被感染的患者，还可以作为潜在的预防手段，保护一线医务人员远离COVID-19的危害，加速下一步疫苗和药物的研发。

致谢：感谢上海药物研究所及上海科技大学分享COVID-19病毒Mpro晶体结构，感谢华东理工大学唐赟教授课题组在分子对接上的支持。