猪腰豆质量控制研究

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【摘 要】目的：建立猪腰豆药材质量控制的方法。方法：采用TLC法进行定性鉴别，采用HPLC法进行定量分析，色谱柱为COSMOSIL5C18-PAQ，以甲醇-0.2%磷酸为流动相梯度洗脱，柱温为35 ℃，流速为0.8 mL/min。结果：薄层色谱特征斑点清晰，专属性强。刺芒柄花苷浓度范围在0.001 8～0.014 1 mg·mL-1内呈良好的线性关系;线性回归方程为Y=6.193×104X-0.65（r=0.999 9）;刺芒柄花素浓度范围在0.001 3～0.010 0 mg·mL-1内呈良好的线性关系;回归方程为Y=1.873×104X-0.521（r=0.999 8）;精密度、重复性、稳定性及加样回收试验结果均符合质量标准研究的要求。结论：TLC法专属性强、重复性好，HPLC法灵敏度高、操作方法简单，本研究可为猪腰豆药材的进一步开发研究及建立质量标准提供实验参考。

【关键词】猪腰豆;薄层色谱法;高效液相色谱法;含量测定

【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2020）03-0086-04

猪腰豆[Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn]又名大荚藤、细梗惠特木、白藤花、猪腰子。猪腰豆是豆科（Leguminosae）猪腰豆属（Whitfordiodendron Elmer）植物[1-3]的药用部位，主要分布于云南、广西等地。猪腰豆可药用、食用。在民间，猪腰豆一般被当做补肾助阳、清热解毒的药物，且其藤茎还被用来治疗跌打损伤、祛风补血、调理月经，其花可食用[4]。刘玉娇[5]对猪腰豆的有效成分及药理作用进行了研究，结果表明黄酮类化合物是猪腰豆药材的主要有效成分之一，具有抗心血管疾病等多种活性[6]。

芒柄花黄素（Formononetin，Form）又名刺芒柄花素，为黄酮类化合物，是一种富含黄芪侧根的异黄酮类植物雌激素[7]。通过查阅文献，众多学者对刺芒柄花素的成分含量、药理作用及对癌细胞进行了研究。韦建华等人[8-9]从壮药两粤黄檀中提取分离得到芒炳花黄素。张华[10]采用了高效液相色谱（HPLC）法测定芒炳花素的含量。韩明阳等人[11]采用高效液相色谱波长切同时测定康复春口服液中黄芪指标性刺芒柄花素的成分。黄保胜等人[12]通过SphK1-SIP信号通路抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注的影响，具有改善脑缺血，降低脑含水量，具有保护作用[13]。费洪新等人[14]研究芒柄花黃素对阿尔茨海默病小鼠结构的影响。董陈诚等人[15]研究发现，芒柄花黄素能抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖，促进细胞凋亡。已有研究表明芒柄花黄素能抑制膀胱癌T24细胞和EJ细胞增殖、对膀胱癌T24细胞的增殖起显著抑制作用[16]。王茹月等人[17]提出芒柄花黄素对乳腺、前列腺、膀胱、肺、子宫内膜、卵巢对多种恶性肿瘤显示出良好的抑制作用。在一定浓度范围内，芒柄花黄素对恶性肿瘤的抑制作用呈剂量-时间依赖性。但在某些实验中较低浓度芒柄花黄素对癌细胞抑制作用不明显，甚至促进癌细胞增殖[18-19]。芒柄花黄素具有对机体损伤的保护作用、降低血清LDL胆固醇、改善骨密度、调节激素分泌等预防保健功效，对人体内环境和稳态起到良性调节，这可能是它发挥抗癌作用的重要机制之一。例如，芒柄花黄素能有效抑制雌激素依赖性子宫内膜癌细胞中FOXA1和GATA-3蛋白的表达而使雌激素受体水平下降，改善体内的内分泌微环境，从而改善患者预后[20]。此外，芒柄花黄素的抗炎作用可以帮助机体清除代谢废物，使机体处于良好的适于正常细胞代谢的环境，增强机体对癌细胞的免疫力。

猪腰豆中所含的有效成分虽被报道有多种治疗作用，但目前对其质量控制还未形成系统性的标准，国内外对猪腰豆的质量标准研究几乎空白。本实验对猪腰豆采用薄层色谱法进行定性分析并采用高效液相色谱法进行含量测定，为更深入地对猪腰豆的品质评价标准进行探讨，并期望在开发猪腰豆抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抑细菌、抗衰老等药物中提供实验基础，为猪腰豆的质量控制提供科学依据。

1 实验药材、试剂与仪器

（1）实验药材。猪腰豆采集于广西南宁，由广西中医药大学韦松基教授鉴定为猪腰豆（Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn）的地上部分。

（2）实验试剂见表1。

（3）仪器设备见表2。

2 实验方法与结果

（1）薄层鉴别。

（2）猪腰豆供试品溶液的制备。称取药材粗粉适量，过三号筛，取药材粉末约6 g，置于具塞锥形瓶中，加入MeOH溶剂30 mL，超声波提取30 min，滤过，滤液浓缩至1 mL即得。

（3）刺芒柄花素对照品溶液的制备。取刺芒柄花素对照品约1 mg，加入甲醇进行溶解，即得对照品溶液。

（4）刺芒柄花苷对照品溶液的制备。取刺芒柄花苷对照品约1 mg，加入甲醇进行溶解，即得对照品溶液。

（5）薄层色谱试验及结果。根据2015版《中国药典》四部通则0502试验，取硅胶G薄层板，105 ℃活化30 min后，吸取供试品溶液、刺芒柄花素对照品溶液、阴性对照品溶液2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）为展开剂展开，展距为7 cm，取出，晾干。在紫外光灯（365 nm）下检测。结果显示刺芒柄花素对照品和猪腰豆供试品在相同的Rf值位置上显相同颜色斑点，分离度好、斑点清晰（如图1所示）。

根据2015版《中国药典》四部通则0502试验，分别吸取供试品溶液、刺芒柄花苷对照品溶液、阴性对照品溶液2～5 μL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）为展开剂展开，展距为7 cm，取出，晾干。在紫外光灯（365 nm）下检测，结果显示刺芒柄花苷对照品和猪腰豆供试品在相同的Rf值位置上显示相同颜色斑点，分离度好、斑点清晰（如图2所示）。

3 含量测定方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：COSMOSIL5C18-PAQ色谱柱（250 mm×4.6 mm;5 μm）;流动相：甲醇（C）～0.2% 磷酸水溶液（D）;梯度洗脱。流速：0.8 mL/min;检测波长：双波长切换检测（见表3）;柱温为35 ℃;进样量为10 μL。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取刺芒柄花苷对照品3.060 0 g，加甲醇定容至10 mL，得到刺芒柄花苷对照品浓度为0.306 0 mg/mL，精密称取刺芒柄花素对照品1.150 0 g，加甲醇定容至5 mL，得到刺芒柄花素对照品浓度为0.230 0 mg/mL。精密取上述刺芒柄花苷对照品溶液20 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花苷浓度为0.004 mg/mL，精密取刺芒柄花素对照品溶液46 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花素浓度为0.007 mg/mL。取上述刺芒柄花苷、刺芒柄花素各1 mL等量混合，得混合对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

取药材粗粉适量，三号筛过滤，取药材粉末约6 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，称重，加热回流提取2 h，滤过，冷却后称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀并滤过。所得滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

4 方法学考察

（1）系统适用性试验。分别精密吸取“3.2”项下混合对照品和“3.3”项下供试品各10 μL，按“3.1”项色谱条件下进样，结果供试品溶液中待测成分色谱峰与对照品溶液色谱峰保留时间一致，并且可达到有效的分离，分离度均大于1.5，表明本方法专属性良好。高效液相色谱图如图3所示。

（2）线性关系考察。分别精密吸取“3.2”项下对照品刺芒柄花素的质量浓度依次为0.001 2 mg/mL、0.003 7 mg/mL、0.006 3 mg/mL、0.007 5 mg/mL、0.010 1 mg/mL，质量浓度依次为0.001 8 mg/mL、0.005 3 mg/mL、0.008 8 mg/mL、0.106 0 mg/mL、0.101 4 mg/mL的刺芒柄花苷各10 μL按“3.1”项下色谱条件进样测定，进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得到刺芒柄花素和刺芒柄花苷的线性范围及标准曲线（如图4所示），结果见表4。

（3）精密度试验。取“3.2”项下混合对照品溶液，分别进样10 μL在“3.1”色谱条件下连续进样6次，计算峰面积结果见表5、表6。

（4）重复性试验。按“3.3”项下方法制备得到6份供试品溶液，分别进样10 μL，按“3.1”色谱条件下检测，计算峰面积结果见表7、表8。

（5）稳定性试验。按“3.3”项下方法制备得到供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分别进样10 μL，按“3.1”色谱条件下检测，记录峰面积，计算刺芒柄花素、刺芒柄花苷结果见表9、表10，刺芒柄花素、刺芒柄花苷峰面积值RSD均小于3%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

（6）加样回收试验。取供试品6份，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按“3.1”色谱条件下测定并记录峰面积，计算各成分加样回收率。结果见表11。

（7）样品含量的测定。取供试品3份，按“3.3”项下制备得到供试品溶液，按“3.1”色谱条件下测定，计算样品中刺芒柄花素、刺芒柄花苷的含量。结果见表12。

5 结论

本次课题对于猪腰豆的TLC鉴别方法专属性强，可用于样品的定性分析。HPLC含量测定方法学结果显示，可用于样品的定量分析。该方法测定结果有较高的准确度，表明所建立的定性、定量分析方法可行，对猪腰豆的鉴定及质量控制具有一定的指导意义和参考价值。

6 讨论

（1）刺芒柄花素展开剂考察。分别考察了石油醚-乙酸乙酯等多种展开体系。通过以上摸索，结果发现，展开剂选用的体积比为二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）时，斑点清晰、分离度好，Rf值为0.57。

（2）硅胶板的考察。分别考察了自铺板和市售板，在相同的样品、对照品及展开条件下，结果显示，自铺板斑点分离差，对照品Rf值为0.50，样品Rf值为0.53;而市售板斑点分离较好，对照品及样品Rf值为0.70，经过对比，市售板点出的斑点较自铺板好。

（3）显色剂考察。黄酮类化合物显色剂采用紫外线氨熏、1%三氯化铝乙醇溶液，結果显示紫外线氨熏显示的斑点更清晰，分离度较好，无拖尾现象;而1%三氯化铝乙醇液结果显示斑点颜色不清晰，有拖尾现象，故选用紫外线氨熏做显色剂。

（4）刺芒柄花苷展开剂考察。因刺芒柄花苷极性较大，分别考察了二氯甲烷-甲醇-冰醋酸等多种展开剂体系。结果发现，展开剂选用甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）时，斑点清晰，分离度较好。

（5）流动相考察。考察甲醇-0.1%磷酸等流动相，结果表明，以甲醇-0.2%磷酸作流动相，基线平稳，故确定流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液。本实验考察60%、70%、80%不同浓度甲醇，加热回流和超声不同提取方式，结果显示，60%浓度回流提取方法更理想，具有良好的分离度、基线较平稳。

（6）柱温考察。分别考察25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱温，结果显示，在35 ℃时，基线较平稳，分离度较好。

（7）波长考察。本次实验对两种成分进行了紫外-分光光度计全波长扫描发现，刺芒柄花苷在230～258 nm处有最大吸收波长。刺芒柄花素在236～248 nm处有最大吸收波长。

参 考 文 献

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