目测法APTT混合纠正试验的鉴别能力评价

彭 政， 唐 宁， 邹志平， 肖 芳

（1.华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北 武汉 430030；2.积水医疗科技有限公司，湖北 武汉 430030；3.湖北省第三人民医院急诊科，湖北 武汉 430030）

活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）延长的潜在原因可分为三大类：缺乏凝血因子、存在凝血因子抗体、存在狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）。凝血因子自身抗体可对人体凝血产生重要影响，其中最为常见的凝血因子自身抗体就是凝血因子Ⅷ抗体[1]。获得性血友病是一种在非血友病患者循环血中以出现凝血因子Ⅷ特异性自身抗体为特征的出血性、自身免疫性疾病，临床较为罕见，因出血突然且严重，患者常因延误诊断而死亡[2-3]。血友病是遗传性凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ缺陷所致的一种出血性疾病，患者在创伤或手术中出血严重，常会出现严重合并症。LA与多发性血栓形成、习惯性流产、系统性红斑狼疮、血小板减少症有关，患者通常不伴出血，隐蔽性强，故对LA进行早期筛查尤为重要[4-5]。

目前，凝血因子Ⅷ抗体和LA的确证试验有相关特定因子定量分析、改良Bethesda法、稀释蝰蛇毒时间（Russell viper venom time，RVVT）法和硅化凝血时间（silicon clotting time，SCT）法，但这些方法成本高、费时、费力，会一定程度延误患者救治。针对这一难题，国际血栓与止血学会推荐使用APTT混合纠正试验，可快速判断凝血异常是由凝血因子低下或缺乏引起，还是由抑制剂（如LA、凝血因子抑制剂）引起，帮助实验室明确检测方向[6]。但目前暂无公认的APTT混合纠正试验检测方法和结果判读标准，不同实验室使用的标准不一，对“纠正”的理解也存在差异。因弱抑制剂可在1∶1混合的状态下被充分稀释而消失，故当APTT、凝血酶原时间只是稍微延长时，APTT混合纠正试验结果会出现一定的偏差。由于上述种种原因，使得开展APTT混合纠正试验的实验室不多。本研究旨在评价目测法APTT混合纠正试验的鉴别能力，并将其与传统Rosner指数法进行比较。

1 材料和方法

1.1 标本

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院APTT延长患者标本62例，所有标本均经确证试验确认，延长原因明确，其中22例为凝血因子Ⅷ抑制剂阳性标本，20例为内源性凝血因子缺陷标本，20例为LA阳性标本。未能及时检测的标本-80 ℃（6个月）或-20 ℃（14 d）冷冻保存。采用CP2000凝血分析仪及APTT试剂[积水（日本）医疗株式会社]进行检测。

1.2 正常混合血浆的制备

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院新鲜凝血试验标本20例，所有标本凝血四项结果均在正常范围内，且无溶血、无黄疸，排除妊娠、肝炎病毒阳性及人体免疫缺陷病毒抗体阳性的患者标本[7]。标本充分混匀后，1 500×g离心10 min，取上层血浆于无菌杯中，并分装于Eppendorf管中。同时取2份适量血浆，一份直接进行凝血四项检测，另一份置于37 ℃水浴箱中温育1 h，再进行凝血四项检测。若2份标本凝血四项检测结果均正常，则将该标本置于-80 ℃保存[8]。本研究因自制血浆成本低，使用方便，故未使用商品化正常混合血浆，但自制正常混合血浆不宜多次反复冻融。

1.4 方法

1.4.1 目测法APTT混合纠正试验 将正常混合血浆于37 ℃水浴箱中复融5 min。（1）即时型纠正试验。将正常混合血浆、患者血浆直接上机检测，设置两者混合比例模式；（2）延迟型纠正试验。手工配置正常混合血浆和患者血浆混合比例，充分混匀后于37 ℃水浴箱中温育2 h[9]，再上机检测。见图1、表1。

图1 目测法APTT混合纠正试验流程

表1 目测法APTT混合纠正试验血浆混合比例

为了更加客观地评价检测结果，需对面积比（area rotio，AR）值进行分析。根据AR值将结果图分为3种曲线型：抑制剂型、缺陷型和可疑抑制剂型[10]。在一个矩形中，对角线将其分为下三角形（Ⅰ区）和上三角形（Ⅱ区），当Ⅰ区面积等于Ⅱ区面积时，AR值为100%。当Ⅰ区面积大于Ⅱ区面积时，为凸曲线型，即抑制剂型（AR≥108%）；当Ⅰ区面积小于Ⅱ区面积时，为凹曲线型，即缺陷型（AR≤94%）；另有可疑抑制剂型（AR为95%～107%），图形近似直线，但不能被归为凸曲线型，该类型提示可能包含凝血因子抑制剂。见图2。

图2 模拟模式识别曲线

1.4.2 Rosner指数法 将正常混合血浆于37℃水浴箱中复融5 min。按Rosner指数法常用血浆的配置要求，配制1～3管血浆，管1正常混合血浆0.5 mL，管2正常混合血浆0.25 mL+患者血浆0.25 mL，管3患者血浆0.5 mL。将管1～3上机检测，计算Rosner指数，即（1∶1混合血浆APTT—正常混合血浆APTT）/患者血浆APTT×100%。Rosner指数＞11提示可能为抑制剂型，Rosner指数＜11提示可能为缺陷型。

将3管血浆于37 ℃水浴箱中温育1 h后，检测管2 APTT，同时将温育后的0.25 mL管1血浆与0.25 mL管2血浆混合，立即检测APTT，记录APTT差值。若差值＞10 s，则判断为存在时间依赖性抗体。

2 结果

2.1 凝血分析仪检测结果

即时反应曲线呈凹曲线型，延迟反应曲线呈凸曲线型，提示存在凝血因子抑制剂，见图3。即时反应与延迟反应曲线均呈凸曲线型，提示存在LA，见图4。即时反应与延迟反应曲线均呈凹曲线型，提示凝血因子缺陷，见图5。

2.2 Rosner指数法与目测法APTT混合纠正试验验证结果

对于20例凝血因子缺陷标本，目测法APTT混合纠正试验与Rosner指数法均能100%检出，见表2。对于20例LA阳性标本，目测法APTT混合纠正试验与Rosner指数法均检出19例（7号标本2种方法均未能检出），见表3。对于22例凝血因子抑制剂阳性标本，目测法APTT混合纠正试验检出21例（1号标本未能检出），50%点差值法检出21例（6号标本未能检出），见表4。

2.3 3种方法检测凝血因子缺陷、LA及凝血因子抑制剂的敏感性

图3 凝血因子抑制剂标本曲线

图4 LA标本曲线

图5 凝血因子缺陷标本曲线

表2 凝血因子缺陷组2种方法验证结果

表3 LA组2种方法验证结果

表4 凝血因子抑制剂组2种方法验证结果

对于凝血因子缺陷标本，目测法APTT混合纠正试验与Rosner指数法的敏感性均为100.0%。对于LA阳性标本，目测法APTT混合纠正试验与Rosner指数法的敏感性均为95.0%。对于凝血因子抑制剂阳性标本，目测法APTT混合纠正试验与50%点差值法的敏感性均为95.5%。

3 讨论

APTT混合纠正试验是分析APTT延长原因简单而实用的工具，但由于目前暂无公认的APTT混合纠正试验检测方法和结果判读标准，且对何时需运用APTT混合纠正试验也无共识，因此目前仍有许多医院未开展此检测项目，导致临床医生对部分不明原因的APTT延长结果判断存在困惑。

目测法APTT混合纠正试验、Rosner指数法及50%点差值法对内源性凝血因子缺陷、即时反应抑制剂、延迟反应抑制剂均有较高的鉴别敏感性。目测法APTT混合纠正试验可直接通过观察曲线区分三者，简单、易判。

针对延迟反应抑制剂的判断，本研究采用混合比例50%血浆温育前后差值＞10 s作为判断阈值，而华中科技大学同济医学院附属同济医院在采用STAGO全自动血凝分析系统（法国STAGO公司）时，以温育1 h后延长3 s作为判断阈值，提示存在较大系统间差异，难以标准化。目测法作为定性判断方法，对系统依赖性较小，更有助于APTT混合纠正试验的标准化。

目测法APTT混合纠正试验采用凝血分析仪自动按比例混合血浆进行检测，对标本需求量少，本研究只需125 μL患者血浆就可完成5点即时型纠正试验，而传统APTT混合纠正试验标本需求量较大。此外，Rosner指数法只用到50%的混合比例，当APTT稍延长，存在弱抑制剂时，50%混合比例可能会使抑制剂因被稀释而消失，而多点稀释功能可减弱此影响。

综上所述，目测法APTT混合纠正试验可快速对APTT延长的可能原因进行初步鉴别，结果直观，对操作要求较低，适用于不能随时进行凝血因子抑制剂、LA检测的临床实验室。