御唐丸对2型糖尿病大鼠空腹血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、甘油三酯、总胆固醇水平及胰腺组织胰岛素表达的影响※

郑 南 谢 宁 李 全 周妍妍 高丽娟

(黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

糖尿病是一种内分泌代谢紊乱性疾病，其特征为慢性持续性的血糖浓度增高、糖耐量异常及尿糖结果阳性，并可伴有脂质代谢异常。根据糖尿病发病原因的不同，临床中又以2型糖尿病为主，且随着人们饮食结构的改变，2型糖尿病发病率呈逐年升高趋势[1]。近年来大量临床研究显示，中医药对于2型糖尿病在控制血糖、改善胰岛素抵抗、提高胰岛素表达等方面疗效确切，且具有毒副作用小、依赖性小的特点[2]。御唐丸是黑龙江中医药大学谢宁教授结合自己多年的临床经验研制而成的纯中药复方制剂，临床研究表明其对2型糖尿病疗效确切[3]。为进一步阐述御唐丸的作用机制，我们观察御糖丸对糖尿病模型大鼠空腹血清胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平及胰腺组织胰岛素表达情况的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠150只，体质量180～200 g，周龄8周，采购于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物合格证号：SYXK(黑)2017-012。

1.2 药物 御唐丸(主要由黄芪、山茱萸、龟版、乌梅、女贞子、麦冬、山药、白芍、鹿茸、西洋参、玉竹及葛根组成，由黑龙江省中西医结合研究所制剂室负责加工制作)；糖尿乐胶囊(河南辅仁堂制药有限公司，国药准字Z10983076)；盐酸二甲双胍片(北京京丰制药集团有限公司，国药准字H11021518)。

1.3 主要试剂及仪器

1.3.1 试剂 大鼠胰岛素酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒、TC测定试剂盒、TG测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；胰岛素免疫组化检测试剂盒(上海一研生物科技有限公司)。

1.3.2 仪器 Infinite F50全自动酶标仪(瑞士Tecan公司)；ZY-1280型全自动生化分析仪(上海科华生物工程股份有限公司)；BX60生物显微镜(日本Olympus公司)；紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；快速血糖仪(德国罗氏公司)；组织包埋机、石蜡切片机(澳大利亚Daintree Scientific公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 将150只SD大鼠随机分为空白对照组20只及造模组130只。空白组予基础饲料喂养。造模组予高脂高糖饮食喂养，并采用STZ腹腔注射法建立2型糖尿病模型[6]，连续喂养10周，以大鼠空腹腹腔注射血糖(FPG)>16.7 mmol/L且维持1周以上表示造模成功。最后共108只造模成功。

1.4.2 分组及给药 将造模成功的108只大鼠随机分为御唐丸高剂量组、御唐丸低剂量组、糖尿乐胶囊组、盐酸二甲双胍组及模型对照组，每组20只，剩余8只大鼠剔除。御唐丸高、低剂量组分别按2.70、1.35 g/(kg·d)予御唐丸药液灌胃，糖尿乐胶囊组按0.09 g/(kg·d)予糖尿乐胶囊药液灌胃，盐酸二甲双胍组按2.43 g/(kg·d)予盐酸二甲双胍片药液灌胃，空白对照组及模型对照组分别予2 mL/d蒸馏水灌胃。各组大鼠均连续灌胃8周。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 标本采集 各组大鼠均在末次给药后禁食水12 h，然后通过摘除眼球取血的方法获得全血，室温静置1 h，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃冷冻保存。取血完毕后采用脱颈法处死大鼠，解剖并摘取胰腺组织，置于4%的多聚甲醛固定液中固定，备用。

1.5.2 FINS检测及HOMA-IR计算 各组大鼠取血后首先采用快速血糖仪进行FPG检测，然后均取定量血清，采用ELISA法进行FINS检测，严格按照试剂盒操作说明书进行测定。得到FPG及FINS数值后再根据公式计算HOMA-IR。计算公式：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.5.3 TG及TC检测 各组均取定量血清，采用全自动生化分析仪进行检测，严格按照试剂盒操作说明进行测定。

1.5.4 胰腺组织胰岛素表达检测 采用免疫组化染色法对各组大鼠胰腺组织胰岛素表达进行检测。主要步骤：用石蜡包埋胰腺组织并切片，60 ℃恒温烤箱中至少烤片1 h，放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次，每次10 min，梯度乙醇水化，每次2 min；按照一抗的需要，采用抗原修复液对组织切片进行抗原修复处置，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次；封闭缓冲液封闭，37 ℃孵育30 min，滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3次；封闭缓冲液封闭，37 ℃孵育10 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-SA)(浓度1∶50～200)，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5次；使用二氨基联苯胺(DAB)溶液显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，甘油封固剂封片。最后在显微镜下观察，并采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统[麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司]进行分析，棕黄色颗粒为阳性表达，淡蓝色背景为阴性表达，阳性目标面积占统计场面积的百分比就是阳性目标面密度，记录数值。

2 结 果

2.1 大鼠入组情况 实验过程中，各组部分大鼠由于高血糖水平、STZ毒性及灌胃不当等原因出现死亡，灌胃8周后共计死亡29只，最终每组各选取顺利完成实验的8只大鼠进行统计分析。

2.2 各组大鼠灌胃后血清FINS及HOMA-IR水平比较 见表1。

组 别nFINS(mmol/L)HOMA-IR空白对照组88.83±1.261.71±0.16模型对照组838.08±2.01∗41.02±4.75∗糖尿乐胶囊组833.89±2.21△26.46±2.92△盐酸二甲双胍组837.82±2.69△20.86±1.98△御唐丸低剂量组834.57±4.93△23.08±3.02△#御唐丸高剂量组829.54±1.82△#□◇21.23±2.72△#

与空白对照组比较,*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与糖尿乐胶囊组比较,#P<0.05；与盐酸二甲双胍组比较,□P<0.05；与御唐丸低剂量组比较，◇P<0.05

由表1可见，与空白对照组比较，模型对照组灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，糖尿乐胶囊组、盐酸二甲双胍组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明显下降(P<0.05)。与糖尿乐胶囊组比较，御唐丸高剂量组灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明显降低(P<0.05)，御唐丸低剂量组灌胃后HOMA-IR水平明显降低(P<0.05)。与盐酸二甲双胍组比较，御唐丸高剂量组灌胃后FINS水平明显降低(P<0.05)，HOMA-IR水平与其相当(P>0.05)，御唐丸低剂量组FINS及HOMA-IR水平与其比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与御唐丸低剂量组比较，御唐丸高剂量组灌胃后FINS水平明显降低(P<0.05)，HOMA-IR水平与其相当(P>0.05)。

2.3 各组大鼠灌胃后血清TC及TG水平比较 见表2。

组 别nTCTG空白对照组81.21±0.090.38±0.05模型对照组82.81±0.60∗1.44±0.51∗糖尿乐胶囊组82.27±0.31△1.14±0.22△盐酸二甲双胍组81.57±0.28△0.65±0.15△御唐丸低剂量组82.26±0.28△□0.85±0.14△#御唐丸高剂量组81.68±0.17△#◇0.67±0.15△#

与空白对照组比较,*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与糖尿乐胶囊组比较,#P<0.05；与盐酸二甲双胍组比较,□P<0.05；与御唐丸低剂量组比较，◇P<0.05

由表2可见，与空白对照组比较，模型对照组灌胃后TC及TG水平均明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，糖尿乐胶囊组、盐酸二甲双胍组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组灌胃后TC及TG水平均明显降低(P<0.05)。与糖尿乐胶囊组比较，御唐丸高剂量组灌胃后TC及TG水平均明显降低(P<0.05)，御唐丸低剂量组灌胃后仅TG水平明显降低(P<0.05)。与盐酸二甲双胍组比较，御唐丸高剂量组灌胃后TC及TG水平与盐酸二甲双胍组相当(P>0.05)，御唐丸低剂量组TC水平则明显高于盐酸二甲双胍组(P<0.05)。与御唐丸低剂量组比较，御唐丸高剂量组灌胃后TC水平明显低于御唐丸低剂量组(P<0.05)，TG水平与其相当(P>0.05)。

2.4 各组大鼠灌胃后胰腺组织胰岛素表达情况比较 见表3。

组 别n胰腺组织胰岛素空白对照组56.260±1.104模型对照组50.570±0.123∗糖尿乐胶囊组50.875±0.179盐酸二甲双胍组52.224±0.535△御唐丸低剂量组51.589±0.402△御唐丸高剂量组53.003±0.845△#◇

与空白对照组比较,*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与糖尿乐胶囊组比较,#P<0.05；与御唐丸低剂量组比较，◇P<0.05

由表3可见，与空白对照组比较，模型对照组灌胃后胰腺组织胰岛素表达明显降低(P<0.05)。与模型对照组比较，盐酸二甲双胍组、御唐丸低剂量组及御唐丸高剂量组灌胃后胰腺组织胰岛素表达均明显升高(P<0.05)，糖尿乐胶囊组表达虽也有升高趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。与糖尿乐胶囊组比较，御唐丸高剂量组灌胃后胰腺组织胰岛素表达明显升高(P<0.05)，御唐丸低剂量组表达虽也有升高，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。与盐酸二甲双胍组比较，御唐丸高、低剂量组灌胃后胰腺组织胰岛素表达水平与其比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与御唐丸低剂量组比较，御唐丸高剂量组灌胃后胰腺组织胰岛素表达水平明显升高(P<0.05)。

2.5 各组大鼠灌胃后胰腺组织胰岛素免疫组化观察情况 空白对照组：胰岛细胞边界清晰，染色颗粒分布浓密均匀。模型对照组：胰岛细胞被破坏，染色颗粒分布密度不均。糖尿乐胶囊组:胰岛细胞边界模糊，分布紊乱，染色颗粒微见。盐酸二甲双胍组：胰岛细胞边界清晰，染色颗粒分布较少。御唐丸低剂量组:胰岛细胞结构趋于完整，染色颗粒相对明显。御唐丸高剂量组:胰岛细胞结构相对完整，染色颗粒明显。见封3，图1。

3 讨 论

2型糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，与糖尿病家族史、不良饮食习惯、体力活动少、肥胖、酗酒等因素密切相关，同时由于长期高血糖的影响，可导致碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢紊乱，大血管、微血管受损，造成多器官的慢性损伤和功能障碍，而导致一系列并发症[4-5]。2型糖尿病为进展性的疾病，胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍是其发病的主要原因，但在其发生和发展过程中，究竟是胰岛素抵抗先出现，还是胰岛素分泌量不足先出现，尚存在一定争议[6-7]。胰岛素抵抗是指一定浓度胰岛素对葡萄糖代谢所产生的生物反应偏低、生物学效应减弱的现象。胰岛β细胞合成并分泌胰岛素主要由血糖浓度的高低决定，但当机体出现胰岛素抵抗时，胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，正常水平的胰岛素无法激发诱导肌肉和脂肪细胞吸收葡萄糖的信号,血糖浓度不断升高，又会对胰岛β细胞产生刺激作用，进而促使胰腺代偿性合成分泌更大量的胰岛素，产生高胰岛素血症以维持血糖的稳定，而一旦胰岛β细胞受到破坏，在高血糖的情况下无力表达和分泌更多的胰岛素，则说明患者正从单纯的胰岛素抵抗向2型糖尿病转变[8-9]。脂质代谢紊乱也是2型糖尿病最常见的临床表现之一，胰岛素抵抗或胰岛素含量不足均可减弱机体对释放游离脂肪酸(NEFA)的抑制作用，脂肪组织发生快速分解，导致大量NEFA被释放，NEFA通过门静脉循环入肝，促进肝脏分泌大量的TC、TG，导致TC、TG水平明显升高[10]。另外，脂蛋白酯酶是水解TG的关键酶，其活性不仅取决于基因的表达，还与胰岛素的作用密切相关。2型糖尿病患者由于胰岛素水平不足或胰岛素抵抗，导致胰岛素作用减弱，脂蛋白酯酶活性降低，进而出现TG水平升高[11]。本实验结果也显示，模型对照组FINS、HOMA-IR、TC及TG水平较空白对照组均明显升高(P<0.05)，且胰腺组织中胰岛素表达明显降低(P<0.05)。糖尿乐胶囊和盐酸二甲双胍片都是临床上治疗2型糖尿病的常用药，对2型糖尿病均有确切疗效[12-13]，因此我们选为阳性药物进行对照观察。本实验结果也显示，糖尿乐胶囊和盐酸二甲双胍片对糖尿病模型大鼠血清FINS、HOMA-IR、TC、TG均有不同程度的改善。

2型糖尿病属中医学消渴范畴，《内经》中有消渴、消瘅、肺消、晶消、消中等10余种病名[14]。《素问·奇病论》曰：“此五气之溢也，名曰脾瘅。夫五味入口，藏于胃，脾为之行其精气，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所发也……肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”虽然历代中医学者对2型糖尿病的病因、病机认识各不相同，治疗方法也各有侧重，但均以健脾补肾为重，认为消渴是以阴虚为本，燥热为标，真阴亏竭于下，相火妄动于上，水火失济所致。脾为后天之本，主升清，运化水谷精微，濡养五脏六腑，若气机升降失常，脾所化生之精微不得上达反而直趋下行，终致阴精自小便而出。肾藏先天之本，主纳气，肾阳充足则气化、蒸腾作用如常，肾阳不足，津液代谢异常，津液向上输布无力则口渴欲饮，膀胱失于气化则小便量多频数。御唐丸正是谢宁教授以健脾补肾、益气养阴为法治疗2型糖尿病的经验方。方中黄芪、西洋参健脾益气，滋阴补肾，养阴生津；玉竹养阴润燥，生津止渴；麦冬重滋肺胃，与西洋参合用又走肾水，金水肺肾相济，止渴生津润燥；山茱萸补肝益肾，收敛固涩；山药补中益气，消渴生津，山药重补脾之阴精，黄芪重补脾之阳气，两药共用，化漏浊，益脾精，助脾胃运化；葛根升阳止泻，生津止渴；鹿茸补肾壮阳，补精益髓；乌梅收敛生津，清热除烦；龟版滋阴潜阳,补肾健骨；女贞子补肾填精；白芍养血调经，敛阴止汗。纵观全方，配伍精当，共奏健脾补肾、益气养阴之功效。现代药理研究表明，黄芪主要含有氨基酸类、微量元素、黄酮类、皂甙、多糖等成分，能够减少胰岛β细胞的凋亡，并促进胰岛β细胞合成并分泌胰岛素[15]；西洋参的主要活性成分是人参总皂苷，能够促进胰岛组织合成并分泌胰岛素，抑制胰岛β细胞凋亡，提高机体摄取和消耗葡萄糖的能力，对糖、脂代谢通路产生影响，减少肠道对脂肪及葡萄糖的吸收[16]；女贞子中的齐墩果酸对糖尿病大鼠具有良好的降血糖、降血脂效果，并且齐墩果酸还具有抗自由基损伤的作用,可增强机体的抗氧化能力[17]；玉竹多糖对STZ诱导的糖尿病大鼠血糖有显著的抑制作用,可增加机体对葡萄糖的摄取，促进肌糖原合成[18]。本实验结果也显示，御唐丸高、低剂量组干预后，血清FINS、HOMA-IR、TC、TG水平及胰腺组织胰岛素表达情况较模型对照组均有明显改善(P<0.05)，且御唐丸高剂量组FINS、TC水平及胰腺组织胰岛素表达情况改善优于御唐丸低剂量组(P<0.05)，且其治疗效果优于糖尿乐胶囊，基本与盐酸二甲双胍片相当，并在降低FINS水平方面优于盐酸二甲双胍片(P<0.05)。

综上所述，御唐丸对糖尿病大鼠具有确切疗效，可明显降低大鼠血清FINS水平，，提高胰腺组织的胰岛素的表达，减轻胰岛素抵抗情况，降低TC及TG水平，改善脂质代谢，且具有一定的量效关系，高剂量水平可能效果更佳。