基于网络药理学探讨润通莱蜜丸对慢传输型便秘小鼠的作用机制

崔长升，齐 滨，刘 莉，张昊旻

(1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.长春中医药大学康复医学院，长春 130117)

慢传输型便秘(slow transit constipaton，STC)是临床常见的顽固性功能性便秘，其特征是结肠推进力减弱，内容物通过减慢，病因至今尚不清楚[1]。随着社会经济的发展，生活节奏加快，精神压力加重，慢传输型便秘的发病率呈增高趋势[2]。便秘患者在短期内可增加了胃肠道发生肿瘤的风险，其中主要为结肠癌[3]。所以对便秘患者进行早期治疗尤为重要。润通莱蜜丸由莱菔子、白术、枳实、蜂蜜经科学方法精制而成的复方丸剂，具有健脾理气，润肠通便等功效，临床上主要用于治疗多种因素导致的STC。

网络药理学是以系统生物学和多向药理学为理论基础的研究方法，通过构建药物、靶点、通路、疾病之间的复杂网络来探讨药物的作用机制[4]。现采用网络药理学对润通莱蜜丸的作用靶点进行预测，再通过动物实验进行验证，初步阐明润通莱蜜丸治疗STC的作用机制，为临床使用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

ICR(institute of cancer research)小鼠，体重为(20±2) g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；动物等级：SPF级；合格证编号为SCXK(吉)2016-0003。

1.2 实验药物

白术、莱菔子、枳实配方颗粒均购自广东一方制药有限公司，批号：720331；盐酸洛哌丁胺胶囊为西安杨森制药有限公司产品，批号：180726655；枸橼酸莫沙必利片为江苏豪森药业集团有限公司产品，批号：181003。

润通莱蜜丸由白术40份、莱菔子40份、枳实40份、蜂蜜500份，加热160 ℃，搅拌10 min，形成浓稠液体，冷却至30 ℃，取5 g制成丸剂，再次冷却4 ℃保存待用。

1.3 实验试剂

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒，购自Solarbio；cox-1、cox-2试剂盒购自上海优选生物科技有限公司；甲醛、二甲苯均购自北京化工厂。

1.4 实验设备

高速冷冻离心机[ST-40R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；酶标仪(Infinite M200 Pro型)；轮转切片机(RM2245型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；自动包埋机(EG1150H型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；烘片机(HI1220型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；铺片机(HI1210型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；三用恒温水浴槽(DK-420S，上海精宏实验设备有限公司)；体视显微镜(尼康SMZ25型，北京瑞科中仪科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 网络药理学预测润通莱蜜丸治疗STC的靶点

2.1.1 白术、枳实、莱菔子成分收集、活性化合物及靶标蛋白的筛选

借助中药系统药理学分析平台(Chinese medicine system pharmacology analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分别以“白术”“枳实”“莱菔子”为关键词检索白术、枳实、莱菔子中的化学成分。筛选出白术、枳实中符合生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18及莱菔子中符合OB≥30%和DL≥0.15作为活性成分及收集其对应的相关靶标蛋白。

2.1.2 疾病基因的筛选

通过GenCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“slow transit constipaton”为关键词检索与STC相关的基因。

2.1.3 白术、枳实、莱菔子作用靶点与慢传输型便秘相关靶点交集

利用在线Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘图软件绘制润通莱蜜丸作用靶点与STC相关靶点交集基因的Venny图。

2.1.4 活性成分-靶点网络构建

利用cytoscape(3.7.1)(https://cytoscape.org/)软件构建化学成分-靶点网络，探讨润通莱蜜丸治疗STC的作用机制。

2.2 润通莱蜜丸对STC的治疗作用及机制

2.2.1 分组及模型制备

取小鼠50只，分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、低剂量组、高剂量组，每组10只。空白对照组，予以蒸馏水(0.1 mL/10 g)灌胃，其余组按盐酸洛哌丁胺胶囊(1.5 mg/kg)经口灌胃，每天2次，连续灌胃21 d[5]。造模成功后，空白对照、模型对照组，给予蒸馏水(0.4 mL/20 g)灌胃；阳性对照组给予枸橼酸莫沙必利片(2.5 mg/kg)经口灌胃；低剂量组、高剂量组给予润通莱蜜丸(25 mg/10 g、50 mg/10 g)经口灌胃(灌胃前用蒸馏水将润通莱蜜丸稀释成液体)，每天2次，共7 d。

2.2.2 测定小肠炭末推进率

在治疗第7 d，禁食不禁水24 h后，给予各组小鼠炭末汁0.4 mL，炭末汁灌胃完成后即开始记录时间，30 min后小鼠脱颈处死，肠管总长度为幽门至所剪回盲处长度，炭末推进长度为从幽门至炭末汁前端处。小肠炭末推进率(%)=炭末推进长度(cm)/肠管总长度(cm)×100%。打开腹腔，观察小鼠结肠内粪便性状、计算结肠内大便粒数。

2.2.3 小鼠结肠病理结构的观察

选取小鼠结肠近肛门部位长约2 cm结肠组织，生理盐水冲洗，10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，常规切片，HE染色，显微观察。

2.2.4 小鼠结肠组织cox-1、cox-2的测定

取出的结肠组织按照器官1∶9(m/V)的比例加入冷生理盐水，匀浆器冰浴研磨制备成10%的结肠组织匀浆，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，低温保存，含量测定均按照cox-1、cox-2试剂盒说明书的方法进行。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 成分收集、活性化合物及靶标蛋白的筛选

通过TCMSP 检索到白术、枳实、莱菔子中化合物172个，其中55个来自白术，65个来自枳实，52个来自莱菔子。以OB≥30%和DL≥0.18，筛选出活性化合物35个，其中7个来自白术，22个来自枳实，6个来自莱菔子。35个活性化合物的基本信息如表1所示。

3.2 疾病基因的筛选

通过GenCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“slow transit constipaton”为关键词检索与STC相关的基因，共筛选得到1 822个相关基因。

3.3 润通莱蜜丸作用靶点与STC相关靶点交集

利用在线Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘图软件绘制润通莱蜜丸作用靶点与STC相关靶点交集基因的Venny图，共得到42个交集基因。结果如图1所示。

图1 润通莱蜜丸作用靶点与STC相关靶点交集Fig.1 The intersection of the target of Runtonglaimi pill and the target of STC

表1 35个活性化合物的OB及DLTable 1 OB and DL of 35 active compounds

3.4 活性成分-靶点网络构建

利用35个活性成分和42个靶点的关系构建活性成分-靶点网络图(图2)。有14个化合物未参与网络绘制。其中枳实中木犀草素、香蜂草苷、柚皮素可分别与21、16、12个靶点基因有连接，白术中白术内酯I可与4个靶点基因连接，莱菔子中谷甾醇可与2个靶点基因连接。靶点基因中连接度最高的是PTGS1，可与14个活性成分连接，PRSS1、PPARG、ESR1、ESR2、ACHE均可与5个以上的活性成分有连接，由此可知，润通莱蜜丸可能主要通过调节PTGS1治疗STC的。

图2 活性成分-靶点网络图Fig.2 Active ingredient-target network diagram

3.5 润通莱蜜丸对小鼠小肠推进率的影响

如表2所示，与空白组相比，模型组小鼠炭末推进率明显降低(P<0.01)，说明盐酸洛哌丁胺使小鼠肠道蠕动减弱，传输功能降低，造模成功；与模型组相比，阳性对照组、低剂量组、高剂量组小鼠的炭末推进率均增高，具有极显著差异(P<0.01)。

表2 润通莱蜜丸对便秘小鼠小肠碳末推进率的影响Table 2 Effect of Runtonglaimi pill on the intestinal carbon adduction rate of constipation

注：##，与空白组相比,P<0.01；**，与模型组相比,P<0.01。

3.6 润通莱蜜丸对小鼠结肠内大便粒数的影响

如表3所示，与空白组相比，模型组小鼠结肠内大便粒数明显增加(P<0.01)，说明盐酸洛哌丁胺使小鼠结肠中大便滞留；观察发现，模型组小鼠结肠内大便，质地坚硬，颜色为黑色。阳性对照组、低剂量组、高剂量组小鼠结肠中大便粒数明显减少，具有极显著差异(P<0.01)，大便颜色无明显变化。

表3 润通莱蜜丸对便秘小鼠结肠内大便粒数的影响Table 3 Effect of Runtonglaimi pill on the number of stool in the colon of constipation

注：##,与空白组相比,P<0.01；**，与模型组相比，P<0.01。

3.7 润通莱蜜丸对小鼠结肠形态结构的影响

如图3所示，与空白对照组相比，模型对照组小鼠结肠黏膜紊乱，肌层明显变薄，并有炎性细胞浸润；与模型组相比，阳性对照组、低剂量组、高剂量组小鼠结肠内黏膜排列正常，高剂量组肌层厚度正常。

图3 润通莱蜜丸对小鼠结肠形态结构的影响Fig.3 Effect of Runtonglaimi pill on colonic morphology of mice

3.8 润通莱蜜丸对结肠组织中cox-1、cox-2表达量的影响

与正常对照组比较，模型对照组小鼠结肠组织中cox-1、cox-2含量明显升高，有极显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，阳性药组、润通莱蜜丸低高剂量组均可降低cox-1、cox-2含量(P<0.01)。试验结果如表4所示。

表4 润通莱蜜丸对慢性传输型便秘小鼠结肠中cox-1、cox-2表达的影响Table 4 Effect of Runtonglaimi pill on the expression of cox-1 and cox-2 in colon of mice with chronic

注：**，与正常对照组比较差异极显著，P<0.01；△，与模型对照组比较差异显著，P<0.05；△△，与模型对照组比较差异极显著，P<0.01。

4 讨论与结论

中医药强调四诊合参、整体辨证，注重调整人体气血津液平衡、脏腑阴阳，因人施治，个体化治疗，在治疗便秘方面历史久远，在临床应用中取得了一定的效果[6]。以行气导滞，润肠通便立法，以莱菔子健脾消食，行气导滞为君药，以蜂蜜补气温中、润燥通便为臣药，佐以枳实健脾行气，佐以白术健脾益气。诸药配伍，共奏行气润肠之功效，以通腑中郁滞，临床上用以治疗多种因素导致的便秘，对治疗慢传输型便秘的患者，效果尤为显著。

在治疗效果考察方面，通过对慢传输型便秘小鼠给予润通莱蜜丸治疗后发现，润通莱蜜丸可提高慢传输型便秘小鼠小肠炭末推进率、减少结肠中大便粒数，减少结肠结构中炎性细胞的浸润，恢复结肠的正常结构。

在作用机制研究方面，利用网络药理学首先对润通莱蜜丸进行了作用靶点进行预测，共有21个化合物和42个靶点参与了网络构建，通过网络图分析，共有14个活性成分与PTGS1有连接，据此推测润通莱蜜丸可能主要通过调节PTGS1缓解STC的。PTGS为环氧合酶，其存在两种同工酶，即PTGS1(cox-1)和PTGS2(cox-2)，两个亚型基本蛋白结构相似，二者与结直肠癌的发生密切相关[7]。环氧化酶(COX)及其产物参与机体的肿瘤新生、血压调节、炎症反应、凝血平衡等多种生理和病理过程，近年来研究发现COX对肠道运动过程发挥着重要作用[8]。炎症正在成为癌症的一个新标志，花生四烯酸(AA)代谢、环氧化酶家族(COXs)和脂氧合酶(LOX)在AA相关炎症级联中起重要作用，在结肠癌样本中环氧化酶家族(COXs)存在高表达状态[9]，所以对cox-1、cox-2均进行了考察。目前研究者们对治疗慢传输性便秘的机制主要从c-kit[10]、NO[11]、eNOS[12]、水通道蛋白[13]等方面进行了研究，但对cox-1、cox-2研究较少。因此分别对空白对照组、模型对照组、阳性对照组、低剂量组、高剂量组小鼠结肠中cox-1、cox-2的表达量进行了检测，结果表明，润通莱蜜丸低高剂量组均可降低慢传输型便秘小鼠结肠中cox-1、cox-2含量。说明润通莱蜜丸可以通过调节cox-1、cox-2缓解慢传输型便秘的，此外为研究慢传输型便秘提供了新思路。