高效液相色谱法测定复合预混合饲料中的25-羟基维生素D3

张浩然 张亦菲 徐 汀 田 恺 华贤辉 黄家莺*

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

维生素D3在机体中有调节免疫功能，促进骨骼生长及钙化的作用[1]。作为维生素D3在机体内的代谢产物，25- 羟基维生素D3（25-OH-D3）更易被机体吸收[2]，因此在养殖业也得到了广泛应用。相应地，农业农村部第2625 号公告对25-OH-D3的使用限量做出规定，配合饲料中的最高限量：猪50 μg/kg，肉鸡、火鸡100 μg/kg、其他家禽80 μg/kg，但缺乏相关标准进行质量控制。复合预混合饲料是配合饲料中25-OH-D3的主要来源之一，若要从源头控制饲料中25-OH-D3的质量，必须建立复合预混合饲料中25-OH-D3的测定方法。本文建立了复合预混合饲料中25-OH-D3含量测定的方法，能够对其质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪（ACQUITY Arc，Waters 公司）；十万分之一电子天平（AB265-S，METTLER TOLEDO）；25-OH-D3标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，纯度98.2%，批号G155330；甲醇为色谱纯；实验用水为一级水；复合预混合饲料样收集于市场。

1.2 色谱条件

色谱柱型号为Thermo AQUASIL-C18（100 mm×3.0 mm，粒径3 μm），柱温30℃，检测波长264 nm；流速为0.6 mL/min；50 μL 进样；流动相A 为水，流动相B 为甲醇，按照表1 程序梯度洗脱。

表1 梯度洗脱表

1.3 样品溶液的制备

称取复合预混合饲料3 g（精确至0.01 mg）于50 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL 水，超声10 min，再加入甲醇30 mL，混匀，超声提取20 min，冷却后，以甲醇定容；移取30 mL 于离心管中，离心5 min（6000 转/min），将上清液过0.22 μm 滤膜，得到样品溶液。

1.4 标准储备溶液制备

称取25-OH-D3标准品25 mg（精确至0.01 mg）于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇适量使25-OH-D3溶解后，用甲醇定容。保存在-20℃。

1.5 标准系列溶液制备

取标准储备溶液适量于棕色容量瓶中，以85%甲醇溶液定容，配制得到浓度分别为25 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.05 μg/mL 的标准系列溶液。

2 结果与分析

2.1 方法的线性与范围

在0.05 μg/mL～25 μg/mL 浓度范围内，以浓度（x）为横坐标，相应的峰面积值（y）为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性方程y = 133091x - 4634，相关系数r=0.9999。结果表明，本法在0.05 μg/mL～25 μg/mL 浓度范围内，线性良好。

2.2 方法的检测限和定量限

对空白复合预混合饲料样品进行加标，考察其信噪比（s/n）。选择s/n ≥3 的浓度作为检出限，得到检出限为0.2 mg/kg ；选择s/n ≥10 的浓度作为定量限，得到定量限为1 mg/kg。

2.3 方法的准确度和精密度

市场中复合预混合饲料中25-OH-D3含量普遍小于10 mg/kg，因此，选择空白基质中进行1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg三个浓度水平的添加，进行准确度及精密度试验。结果表明，各浓度平均回收率在83.3%～97.1%之间，RSD 在0.4%～2.0%之间，准确度和精密度均较好，详见表2。

表2 方法准确度及精密度的试验结果（n=5）

2.4 样品测定

按本方法对市场收集的各类复合预混合饲料样品进行测定，并对每个样品进行了相当于本底浓度的加标。结果表明，复合预混合饲料中25-OH-D3的含量在2.5 mg/kg ～10.5 mg/kg之间，本底加标回收率在86.7% ～97.0%之间，结果见表3。

表3 实际样品测定结果数据表（n=3）

3 结论

本文所建方法的线性、检出限、定量限、准确度与精确度均能满足复合预混合饲料中25-OH-D3测定要求。