SDS对SB3-12胶束表面电荷密度的调控作用及对药物增溶的影响

邢肇碧，过治军，张雨微，刘君玲，王玉洁，白光月,＊

1河南师范大学化学化工学院，精细化学品绿色制造河南省协同创新中心，绿色化学介质与反应教育部重点实验室，河南 新乡453007

2河南科技学院化学化工学院，河南 新乡453003

1 引言

表面活性剂在水介质中能够形成多种聚集体，在仿生及生物制药方面的应用研究已经取得了长足的进展1-6。其中胶束聚集体是最简单也是应用最广泛的聚集形态，在提高药物分子的溶解度、生物利用度、增强在生理环境下的稳定性和功能性等方面都有重要的研究和应用价值1,5,7。两性离子表面活性剂是一类特殊的两亲分子，从电荷性质的角度考虑，由于相反电荷之间的静电中和作用，具有一定的非离子表面活性剂的特征8-13；当与离子表面活性剂混合时，如极性端基为磺酸基的甜菜碱型表面活性剂SB3-12与阴离子表面活性剂SDS混合，由于SB3-12的季铵正电荷与SDS的DS-阴离子的静电作用10-13，具有类似于相反电荷表面活性剂的强协同效应14，但是不会发生由于电荷中和而聚沉15。这种混合胶束的一个更重要的特征是胶束极性双层的净电荷随着阴离子表面活性剂组分分数的增加连续改变，由电中和转变为负电荷胶束。

两性离子/离子混合表面活性剂对胶束表面电荷密度的调节作用本质上的特征就是能够实现胶束极性层的物理及化学性质的微调，这对与胶束极性层及栅栏层性质相关的各种应用是非常重要的，尤其是在药物应用方面，将会明显地影响药物分子的溶解、缓释、功能性释放、稳定性等。芦丁(Rutin, Quercetin-3-O-Rhamnosylglucoside)是一种常见的膳食类黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗糖尿病等许多药理功能，在临床治疗上已经得到广泛应用16-20。由于芦丁中7位的酚羟基在中性pH下可以部分解离成阴离子，使溶解度提高21，而芦丁的二糖基团能够进一步增加水溶性，与其它黄酮类化合物比较更有利于在生理环境下的输送，尽管如此，在水介质中溶解度低、稳定性差22,23仍然是限制其活性成分生物利用率的主要因素之一。利用表面活性剂聚集体作为芦丁的载体，能够有效地提高芦丁的浓度24,25和活性基团的氧化稳定性26-28。两性离子甜菜碱表面活性剂具有较好的生物相容性和低的细胞毒性8，能够广泛地应用于外用、口服和注射类药剂中。当采用离子表面活性剂作为添加剂调节混合胶束极性层的电荷性质时，能比单一表面活性剂更有效地选择性溶解微溶化合物。

芦丁分子的芳香基团含有四个酚羟基，在水溶液中7位上羟基氢易发生解离，呈现弱酸性21，因此表面活性剂增溶的溶解度受表面活性剂头基的电荷性质影响。研究表明，阳离子(CTAB, TTAB,DTAB)、非离子(Brij78, Brij58, Brij35)和阴离子(SDS)表面活性剂增溶的溶解度依次减小29。芦丁分子通过静电和疏水作用在CTAB球形胶束中增溶，而通过氢键和疏水作用在Triton X-100棒状胶束中增溶20,21,26-28。在负电荷的SDS胶束中，槲皮素或芦丁的负电荷与SDS静电排斥而位于水相侧，疏水的B环位于胶束的栅栏层中29,30。进一步研究证实混合表面活性剂体系(CTAB-Brij58,DTAB-Brij35, SDS-Brij35)比单组分体系对芦丁具有更好的增溶能力29。

Bai等25采用ITC方法研究了CTAC与芦丁的相互作用，得到了在芦丁存在下的CMC和增溶过程的焓变，揭示了静电吸引和疏水作用共同驱动芦丁分子在CTAC胶束中的增溶引起CMC降低，胶束化焓基本不变。在pH = 7.4磷酸钠缓冲液中，表面张力测量表明，由于带负电荷的胆酸钠与槲皮素之间的静电排斥作用，导致了胆酸钠临界聚集浓度增加30。

表面活性剂对黄酮类药物的增溶作用受胶束电荷性质及电荷密度影响，但是迄今为止没有关于连续调节胶束电荷密度并用于药物增溶的研究报道。在这项工作中，采用恒温滴定量热(ITC)、

UV-Vis光谱和1H NMR谱研究了SB3-12与SDS混合表面活性剂的胶束化过程及与芦丁分子的相互作用。分别从宏观热力学及光谱、1H NMR谱变化研究了SDS对SB3-12胶束表面电荷密度的调节作用及SB3-12/SDS混合胶束对芦丁分子的增溶机理。

2 实验部分

2.1 试剂

磺酸甜菜碱(SB3-12) (纯度 ≥ 98.0%，TCI上海化成工业发展有限公司，中国)、十二烷基硫酸钠(SDS) (纯度为99.5%，Aladdin化学试剂公司，中国)、芦丁(Rutin) (纯度为98%，Macklin生化科技有限公司，中国)，D2O (纯度为99.9%，Cambridge Isotope Laboratories, Inc., USA)、Na2HPO4·12H2O(AR, 纯度 ＞ 99.0%)、NaH2PO4·2H2O (AR，纯度 ＞99.0%)，以上试剂直接用于实验中，均没有进一步提纯。pH = 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)用Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O配制。实验用水采用三重纯水蒸馏器(SZ-93, 上海亚荣生化仪器厂)蒸馏获得, 电导率值小于1.50 μS·cm-1。

2.2 等温滴定量热(ITC)

采用 TAM III-nanocalorimeters型等温滴定热量计(Part No 3410，量热池体积为1 mL，美国TA仪器公司制造)测量纯表面活性剂在水溶液中的稀释焓变化、SB3-12/SDS与SB3-12/SDS/Rutin混合体系的相互作用的焓变化。对于热量计的电标定与化学标定、仪器参数设置及详细的操作已经在我们以前的研究工作中发表14,31。实验数据的采集和处理采用仪器自带软件(TAM Assistant Software)分析计算。

在测量表面活性剂的稀释热和CMC时，样品池和参考池中分别加入900 μL溶剂(蒸馏水或缓冲溶液)，滴定剂是浓的表面活性剂溶液。在系统达到热平衡后, 用自动进样推进器(P/N 3810-5，美国TA 仪器公司)推动Hamilton气密封注射器进行定量定时滴定。滴定过程中样品池保持80 r·min−1搅拌速度，滴定的时间间隔为8 min，采用动态校正方法获得热流-时间曲线，每次滴定的观测焓通过仪器自带软件积分计算。当测量表面活性剂与芦丁相互作用时，样品池中初始加入900 μL，0.15 mmol·L-1的芦丁的水溶液(PBS，10 mmol·L−1，pH =7.2)，其它操作与上述表面活性剂的稀释实验相同。实验温度为T= (298.15 ± 0.01) K, 每个实验的结果为三次重复测量的平均值。

2.3 UV-Vis吸收光谱

UV-Vis吸收光谱采用TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)获得。实验的波长扫描范围为200-500 nm，石英比色皿光路长10 mm，恒温温度(298.2 ± 0.1) K。仪器采用与测量样品一致的溶剂校正零点并做参比。光谱扫描波长间隔1 nm，采用仪器自带的UVWin6.0.0软件记录UV-Vis吸收光谱。

2.4 芦丁饱和溶解度的测量

将过量的芦丁分别加入到具有一定浓度的SDS、SB3-12以及不同摩尔比的SB3-12/SDS的磷酸盐缓冲溶液中，经过超声震荡后在常温(±1 °C)下避光静置48 h，得到其饱和溶液。取上清液经过孔径为0.22 μm的微孔膜过滤。再定量取出0.1 mL到0.2 mL的上述滤液，与1 mmol·L−1的HCl溶液0.4 mL和适量的乙醇混合，得到终态体积为4 mL的待测溶液。避光静置5 min后，在361 nm波长下测量吸光度，消光系数为17.9 × 103L·mol−1·cm−1，线性回归系数为0.9995。实验结果为三次重复测量的平均值。

2.5 1H NMR谱

采用400M核磁共振波谱仪(德国Burker公司)测量在重水中溶液的1H NMR谱。

3 结果与讨论

3.1 SB3-12/SDS混合溶液的胶束化

图1所示为不同SB3-12摩尔分数(xSB3-12)的SB3-12/SDS(CT= 25 mmol·L−1)混合体系在磷酸盐缓冲溶液(10 mmol·L−1PBS，pH = 7.2)中的稀释量热结果，即在不同的xSB3-12时，每摩尔(nT=nSB3-12+nSDS)观测焓(ΔHobs)随表面活性剂总浓度(CT)的变化曲线。当用SB3-12的PBS溶液滴定PBS溶剂时，观测焓曲线为负值，显示两个折点。第一个折点对应SB3 -12的浓度是(2.71 ± 0.05) mmol·L−1，为SB3-12在PBS溶剂中的CMC。在CMC之前的观测焓变化主要来源于SB3-12胶束的分解、单体分子的水合及扩散。在CMC之后观测焓值的快速上升部分表明胶束的形成过程。在第二个折点以后的观测焓值逐渐达到趋近于零的稳定值，这对应胶束溶液的稀释过程。由胶束稀释过程焓变的线性部分外推到CMC，并与曲线上CMC点的观测焓的差值为SB3-12的胶束化焓(ΔHmic)32，即ΔHmic= (2.73 ±0.05) kJ·mol−1。图中也给出了SB3-12滴定纯水的观测焓曲线，结果与滴定PBS溶剂的曲线重合，表明PBS浓度为10 mmol·L−1时所对应的离子强度对SB3-12的胶束化过程没有明显的影响。当xSB3-12=0.5时，观测焓在测量的浓度范围内为正值，得到CMC0.5= (0.46 ± 0.02) mmol·L−1，ΔHmic= (−5.74 ±0.05) kJ·mol−1。在xSB3-12处于1.0和0.5之间时，如图1中的插入图所示，在低浓度区间观测焓首先取得一个平台，然后在一个狭窄的浓度区间快速降低到极小值，反映了静电吸引作用(ΔHele)，而后经过胶束稀释(ΔHdil)过程逐渐上升趋近于零。滴定初始的观测焓值主要来源于混合表面活性剂的胶束分解焓，与纯表面活性剂不同的是在胶束解离时，观测焓变包含了混合表面活性剂分子间的静电吸引作用能20,21，因此两种分子的摩尔比越接近于1，胶束解离的观测焓值越大。与纯SB3-12胶束化过程比较，混合胶束内两种分子之间存在较强的静电吸引作用(ΔHele)，造成混合胶束化焓由正值转化为负值，而且混合CMC明显降低，结果示于表1中。这些结果表明两性离子表面活性剂SB3-12与SDS之间具有强的协同效应8,11，而且静电作用也必然使胶束表面的净负电荷随SDS的加入而增加，从而能够用于连续调节胶束表面的负电荷密度。图2为SB3-12与SDS等摩尔比的胶束结构示意图。值得注意的是球型胶束有两个性质不同的极性区域，内层是与阴阳离子对(catanionic)表面活性剂类似的电中和的极性区，外层是松散排列的负电荷区。

图1 在磷酸盐缓冲溶液中SB3-12/SDS混合体系的观测焓(ΔHobs)随CT的变化曲线Fig. 1 Variation of the observed enthalpy (ΔHobs) with CT for mixed SB3-12/ SDS systems in PBS.

表1 混合表面活性剂SB3-12/SDS在PBS中的胶束化参数Table 1 The parameters for the micellization of the mixed SB3-12/SDS in PBS.

图2 SB3-12/SDS为等摩尔比的胶束结构示意图Fig. 2 Scheme of the mixed micelles with SB3-12 and SDS of equi-mole ratio.

两性离子与离子型表面活性剂混合物既具备了相反电荷离子表面活性剂有强的协同效应的优点，又避免了电荷中和造成的catanionic盐沉淀的问题。SB3-12/SDS混合胶束的负电荷密度随SDS比例的增加而增大，因此临界胶束浓度及胶束化焓与介质的离子强度有关。图3所示为xSB3-12= 0.5时在不同缓冲溶液浓度下的观测焓曲线，插入图为处理得到的CMC0.5及ΔHmic，结果也在表1中给出。随着缓冲溶液浓度增加CMC0.5降低、胶束化过程放热值增加，这与离子强度对离子型表面活性剂胶束化参数的影响类似。

图3 在不同浓度的PBS中的SB3-12/SDS混合体系的ΔHobs随CT的变化曲线Fig. 3 Variation of the ΔHobs with CT for the mixed SB3-12/SDS systems at different PBS concentrations.

图4 SB3-12/SDS混合表面活性剂溶液滴定Rutin溶液的ΔHobs随CT的变化曲线Fig. 4 Variation of the ΔHobs with CT for titrating the mixed SB3-12/SDS solution into the rutin solution.

3.2 SB3-12/SDS混合胶束与芦丁的相互作用

图4为SB3-12/SDS混合表面活性剂溶液滴定芦丁溶液的ITC曲线。在不同的xSB3-12时，与图1相比具有类似的变化规律。图4的插入图中以xSB3-12=1和xSB3-12= 0.8为例说明芦丁对SB3-12/SDS胶束化过程的影响。当xSB3-12= 1时，与没有芦丁时SB3-12的CMC和ΔHmic基本相等，但是达到稳定的胶束聚集体所对应的CT由滴定PBS时的Cf= 4.50 mmol·L−1增加到滴定芦丁溶液时的6.49 mmol·L−1，形成胶束的浓度范围Cf−CMC明显加宽。当xSB3-12= 0.8或其它摩尔分数时，同样出现CMC值基本不变，Cf−CMC变大的现象，不同的是滴定芦丁的ΔHele明显地增加，即形成胶束时静电作用能增加。这说明在滴定芦丁溶液时，与SB3-12的季铵阳离子发生静电吸引的芦丁阴离子直接参与了胶束的形成，释放更多的热。即使在等摩尔比的SB3-12/SDS混合体系中，滴定芦丁时也得到较大的负ΔHele，这是由于CMC较大的SDS在混合胶束内有较小的摩尔分数15的结果。当恒定xSB3-12= 0.5而改变PBS浓度时，CMC的变化很小，在误差范围内可以忽略，但是ΔHele的负值总是大于ΔHmic, 而且都随着PBS的浓度增加而变大。

图5 芦丁在混合表面活性剂SB3-12/SDS溶液中的饱和溶解度随xSB3-12变化曲线Fig. 5 Variation of the saturated solubility of rutin in the mixed SB3-12/SDS solutions as a function of xSB3-12.

混合表面活性剂胶束的表面电荷调节的重要作用之一是用于调节对水溶性较小的化合物的增溶作用。当增溶的分子分布于胶束的极性区域或胶束的栅栏层中时，增溶量及释放与胶束表面的电荷性质及电荷密度相关。芦丁药物在生物相容性甜菜碱表面活性剂胶束中的增溶有利于提高药剂的稳定性及生物利用度。另外芦丁在胶束溶液中的饱和溶解度也能体现混合胶束表面电荷性质和密度对相互作用的影响。图5为在恒定SB3-12和SDS的总浓度下，改变xSB3-12时的芦丁饱和溶解度曲线。在测量的所有表面活性剂体系中，芦丁的溶解度皆远远大于不含表面活性剂的PBS溶液的结果((0.17 ± 0.02) mmol·L−1)，表明强的增溶作用的存在，这与芦丁与表面活性剂胶束相互作用的ITC测量结果是吻合的。纯的SB3-12胶束对芦丁有较强的增溶效应，为(1.94 ± 0.02) mmol·L−1，在25 mmol·L−1SDS溶液中的增溶较弱，为(0.58 ± 0.02)mmol·L−1。SB3-12胶束溶液中加入少量的SDS(xSB3-12＞ 0.9)，溶解度发生陡峭的下降，而后随SDS的分数增加逐渐减小，这些规律与混合胶束CMC和胶束化焓(见表1和表2)有相同的变化趋势，表明芦丁的增溶受到胶束极性区电荷密度影响，净的负电荷密度增高，溶解度降低。

表2 SB3-12/SDS混合体系在芦丁存在时的胶束化参数aTable 2 The parameters for the micellization of the mixed SB3-12/SDS systems in the presence of Rutin a.

3.3 芦丁在混合胶束溶液中的UV-Vis吸收光谱

芦丁分子含有四个酚羟基，在酸性水介质中为分子状态，7位上羟基氢解离的pKa1= 7.1 (见图6)21,33。在pH = 7.2的PBS溶液中，芦丁中性分子的摩尔分数xR= 0.44，7位上羟基氢解离后的负离子的摩尔分数xR− = 0.56。Rutin分子在351 nm有一个与B环相关的吸收峰b，在264和255 nm有两个与A环相关的重叠峰a1和a221。当7位氢解离后，b由351 nm红移到368 nm，a1和a2转化为269 nm的单峰34。从图7可以看到，在pH = 7.2的PBS溶液中，电离平衡的结果，得到b = 355.5 nm单峰、a1= 265.5 nm尖峰和a2= 257.5 nm的肩峰。加入SB3-12后，在浓度小于CMC时，各个吸收峰的波长不变，消光系数降低(图中没有给出曲线)；大于CMC以后，b红移到360 nm，a2由肩峰升高为尖峰，a1降低为肩峰。a2和a1峰相对强度的变化说明7位羟基氧离子的电子密度降低，是由于两性的SB3-12的季铵基团对电离的酚羟基有一定的吸电子能力。而B环位于SB3-12中两个极性头之间的亚甲基附近，b发生红移。在SDS胶束溶液中吸收峰a1与a2波长几乎不变，a1的相对值变小，但是仍然保持大于a2的消光系数。b的波长发生了约5 nm的红移，消光系数变大，这说明SDS的增溶作用主要是由于B环嵌入到栅栏层中，而A环暴露在水相中29，静电排斥使解离平衡向R增加的方向移动(图6)。

图6 芦丁的分子结构示意图和一级电离平衡Fig. 6 Scheme of rutin’s structure and its dissociation balance.

图7 芦丁分别在PBS、SB3-12、SB3-12/ SDS混合溶液和SDS中(按照箭头方向)的UV-Vis吸收光谱Fig. 7 UV-Vis spectra of rutin in PBS，SB3-12, mixed SB3-12/SDS and SDS solutions in the arrow direction.

在SB3-12的芦丁溶液中加入SDS，b峰蓝移到与SDS胶束中时近似相等的波长360 nm，这是由于SDS的加入使两性离子的SB3-12胶束转化成有净的负电荷的混合胶束。而逐渐增加的SDS分数使SB3-12的季铵基的吸电子能力逐渐降低，胶束内将有更多的芦丁以分子形式存在，造成a2的消光系数相对于a1明显增加。图7中的插入图以xSB3-12=0.8为例给出胶束化前后各个吸收峰附近光谱的放大图。b峰红移，趋向SDS胶束存在时的吸收波长，而A环两个吸收峰a1和a2的相对强度变化趋向于电荷中和的芦丁分子的光谱，进一步说明了芦丁A环上负离子与SB3-12季铵正电荷的静电作用及负电荷的磺酸基对B环的影响。

3.4 混合胶束溶液中芦丁的1H NMR谱

1H NMR谱对研究分子间相互作用是非常有价值的实验方法，可以从微观的角度得到不同分子间相互作用的信息。纯SB3-12和SDS的1H NMR谱各个H的化学位移已有文献报道35,36。图8(I)为SB3-12、SDS及其混合胶束溶液中两种分子部分氢的1H NMR谱。随着SB3-12摩尔分数的减小，SB3-12的B6氢向高场移动，B9氢向低场移动，SDS的S5氢向低场移动。这些结果说明在混合胶束中SDS的阴离子与SB3-12的季铵基团发生静电作用，使B6质子周围的电子云密度升高，S5质子周围的电子云密度降低，而SB3-12的磺酸基逐渐增加的吸电子能力使B9的电子云密度降低，这与图2中给出的混合胶束模型是一致的。当混合溶液中增溶了芦丁后(图8(II))，B6氢进一步向高场移动，说明芦丁与SDS阴离子共同作用于SB3-12的季铵正电荷。S5和B9的位移与没有芦丁存在时基本一致，很可能是由于胶束中芦丁的净含量较少，不足以显示对它们的影响。

芦丁分子的A和B芳香环上的5个氢(图6)的位移在低场出现，与SB3-12和SDS的位移没有重合37,38，可以用于识别胶束对芦丁的影响。在SB3-12和SDS混合胶束溶液中，如图8(III)所示，随着xSB3-12增加，芦丁A环上的8-H向高场移动、6-H向低场移动、B环的2’-H向高场移动，而5’-H和6’-H的位移基本不变，可以认为芦丁的增溶主要依赖于表面活性剂与A环的作用，很可能是季铵的正电荷与7位羟基的静电作用造成了临近的8-H和6-H分别发生了电子屏蔽效应和去屏蔽效应。

综合在混合胶束溶液中芦丁的UV-Vis光谱、表面活性剂与芦丁的1H NMR谱及表面活性剂与芦丁的相互作用焓变，能够推断出增溶的芦丁与SB3-12中的季铵正离子存在弱的静电作用，是芦丁增溶的主要能量因素，磺酸基团与相隔3个亚甲基的季铵正电荷的中和作用削弱了这种静电作用。在SB3-12胶束溶液中加入负离子的SDS，能够中和SB3-12的正电荷，从而增强磺酸基的负电荷，即可以连续增大胶束表面的负电荷密度，使芦丁的增溶能力降低。

4 结论

采用ITC曲线的观测焓变化研究了SB3-12与SDS混合表面活性剂在不同摩尔分数(xSB3-12≥ 0.5)下的CMC和ΔHmic，结果表明两者存在强的协同效应，CMC和ΔHmic明显降低，得到SDS与SB3-12的弱静电作用的协同效应机理，再结合1H NMR谱，证实了图2所示的胶束结构模型，并且定量地得到胶束形成时的静电作用焓变。芦丁的UV-Vis吸收光谱、增溶了芦丁的SB3-12、SDS及芦丁的1H NMR谱进一步验证了ITC研究得到的结论，而且为识别芦丁分子与胶束的功能基团相互作用的位点提供了依据。这些结果表明SDS能够连续地调节两性离子表面活性剂SB3-12胶束的表面电荷，由纯SB3-12胶束弱的负表面电荷，逐渐增加到类似于阴离子表面活性剂的高的电荷密度，这对模型药物芦丁的增溶造成了显著的影响。