SurA 通过调控鞭毛表达影响伤寒沙门菌生物膜的形成*

韩海霞，徐芸芸，刘 超，陆仁飞*

(江苏省南通市第三人民医院检验科，南通 226006)

伤寒沙门菌是肠杆菌科细菌研究的一种重要模式细菌[1]。伤寒沙门菌感染人类主要引起肠热症，经血流扩散后最终会引起菌血症等其他系统性疾病[2]。细菌在环境中通常不是以单个细菌样式的浮游生长，而是大量细菌聚集在一起生长，以应对复杂的生存环境，细菌通过鞭毛、菌毛及自身分泌的多糖、纤维素、脂质蛋白等基质，相互黏附聚集形成高度组织化的膜样聚合结构，即生物膜[3]。纵观伤寒沙门菌污染食物、胞内生存，胆囊长期定植等几个造成严重危害的关键节点，细菌都有以生物膜生长的形式，生物膜无疑成了最主要的“帮凶”。细菌在食物表面以生物膜的形式存在，可以克服低温、干燥、消毒等不利因素[4]；细菌在单核巨噬细胞内形成生物膜以抵御低渗、强酸及氧化杀伤，最终随着被感染的巨噬细胞进一步扩散[5]；细菌能在胆囊胆结石表面形成生物膜抵御胆汁、抗生素对其的损伤而长期存活[6]。另外，大量研究[7]表明生物膜内的细菌大部分是以“滞留菌”的形式存在，这是一种对目前任何抗生素都不敏感的“休眠期”细菌，因此细菌生物膜已经成为处理伤寒沙门菌感染或其他细菌感染最关键和最棘手的问题。

早在1990年，就发现surA 基因是细菌稳定期生长必不可少的[8]。6年后，SurA 被证明是一种位于细胞内外膜之间的一种类小蛋白样肽基-脯氨酰异构酶，主要作用是运送和组装外膜β-片层蛋白从胞浆通过周质到达外膜，与外膜组装蛋白协同作用，生成外膜蛋白[9-12]。本课题组前期伤寒沙门菌生物膜环境细菌和指数生长期细菌的RNA-seq 数据显示，2个转录组有279 个差异表达的基因，其中，差异表达上调前20 的基因中有5 个是外膜蛋白基因。因此，外膜蛋白在生物膜细菌中高表达，根据SurA 已报道的功能(对外膜蛋白在周质中的运送及正确折叠组装至关重要)，推测周质伴侣蛋白SurA 可能与生物膜的形成有关系。为此，我们构建了surA 基因的缺陷株以及回补株，观察了surA 基因缺陷株、野生株以及回补株的生物膜形成能力，再进一步对SurA 影响生物膜形成能力的机制进行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌野生型(Wild Type,WT)GIFU10007 由日本岐阜大学惠赠。低拷贝阿拉伯糖可诱导载体pBAD 购自Invitrogen 公司。E.coli DH5α 由本实验室保存。surA 基因缺陷株(△surA)、flhD 基因缺陷株(△flhD)、surA 基因缺陷空载体株(△surA-pBAD)、野生空载体株(WT-pBAD)、surA 基因缺陷回补株(△surA-psurA)由本实验室制备和保存。

1.1.2 材料和试剂 胰蛋白胨、酵母浸膏和TSB 培养基购自OXOID 公司；NaCl、无水乙醇和异丙醇购自国药集团；Trizol 购自Invitrogen 公司；L-阿拉伯糖、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和琼脂糖购自Sigma 公司；聚苯乙烯96 孔板购自CORNING 公司；DNA 酶Ⅰ基因组消化试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞公司。

1.1.3 主要仪器 NanoDrop ND-1000 微量核酸定量仪(Thermo)；普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(ABI 2720)；荧光定量PCR 仪、酶标仪(Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据伤寒沙门菌野生株GIFU10007 基因组信息(本实验室测序，未公布)，设计实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)定量引物，引物由苏州泓迅生物公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 缺陷株及回补株的构建 Red 重组法制备surA 基因缺陷株，缺陷株以及回补株的构建同参考文献[13-14]。

1.2.3 细菌培养 将伤寒沙门菌单菌落分别接种于2 mL LB 液体培养基(根据需要添加相应抗生素)，37 ℃、250 r/min 震荡培养过夜。第2 天，1∶100 转接到新鲜培养基(添加相应抗生素和适当浓度阿拉伯糖)，37 ℃、250 r/min 震荡培养至所需的吸光度。

1.2.4 细菌生物膜实验(结晶紫) 将过夜培养的细菌(WT-pBAD、△surA-pBAD、△surA-psurA)1∶100 转接到20 mL TSB 培养基中(Amp 终浓度100 μg/mL，阿拉伯糖终浓度0.1%)继续培养至OD600=0.2，吸取200 μL菌液于无菌聚苯乙烯96 孔板内，孵箱30 ℃静置培养约96 h，培养结束后，吸弃聚苯乙烯96 孔板内菌液，无菌磷酸缓冲盐溶液清洗孔内3 次后烘干，结晶紫溶液对生物膜染色15 min，加入250 μL 30%乙酸溶液溶解生物膜，酶标仪A570 波长测定每孔吸光度。

1.2.5 qRT-PCR 将过夜培养的细菌(WT 和△surA)1∶100 转接到20 mL LB 培养基中，继续培养至指数中期OD600=0.6，冰上放置10 min，4 000 r/min 离心10 min 收集细菌。Trizol 法提取细菌总RNA，经DNA酶Ⅰ消化基因组DNA 后，随机引物进行逆转录反应，同时设置不加逆转录酶参照孔。以cDNA 为模板，用上下游引物进行qRT-PCR，方法参照说明书，实验每次3 个复孔，批间重复3 次，5s rRNA 为内参基因，基因表达量采用2-△△ct法计算。每次实验均设对照组和实验组。

1.2.6 电镜观察细菌鞭毛 将过夜培养的细菌(WT、△surA 和△flhD)继续培养至稳态早期OD600=1.2，菌液冰上放置，送扬州大学农学院生物样本分析中心透射电镜室做电镜拍摄。

2 结 果

2.1 伤寒沙门菌surA 基因缺陷下调细菌生物膜形成能力 伤寒沙门菌生物膜结晶紫实验显示，与野生株(WT-pBAD)相比，缺陷株(△surA-pBAD)生物膜形成能力为野生株(WT-pBAD)的50%，而在缺陷株里回补了surA 基因后，回补株(△surA-psurA)的生物膜形成能力又恢复到野生株水平，说明伤寒沙门菌surA 基因缺陷具有下调细菌生物膜形成的能力(图1)。

2.2 伤寒沙门菌surA 基因缺陷下调鞭毛相关基因表达 为了探索周质伴侣蛋白SurA 影响生物膜形成的机制，我们通过qRT-PCR 检测影响伤寒沙门菌生物膜形成的几个胞外基质及关键调控子在野生株(WT)和缺陷株(△surA)中的表达水平。实验结果显示，与WT 株相比，△surA 菌株中鞭毛相关基因(flhD、fliA、fljB)的mRNA 水平显著下调，其中flhD 和fliB 的mRNA 水平下降为野生株的25%，fljA mRNA水平下降到野生株的10%(图2)。说明surA 基因缺陷后下调伤寒沙门菌鞭毛表达。

表2 生物膜形成相关基质成分与基因

2.3 电镜观察surA 基因缺陷对细菌鞭毛表达的影响 为观察surA 基因缺陷对细菌鞭毛表达的影响，对WT、△surA 及△flhD 菌株进行电镜观察。WT 菌株的鞭毛数约5～8 根(图3A～C)；而△surA 菌株的鞭毛数仅2～3 根，由于动力减弱，通常2～3 个细菌聚集生长(图3D～F)；由于缺失了鞭毛一级调控子FlhD，△flhD 菌株周身无鞭毛，细菌成簇生长(图3G～I)。说明缺失surA 基因后，伤寒沙门菌鞭毛表达的数量明显减少。

2.4 伤寒沙门菌鞭毛是细菌形成生物膜必不可少的基质 为观察伤寒沙门菌鞭毛和细菌生物膜形成能力的关系，利用鞭毛一级调控子FlhD 的缺陷株进行生物膜实验。如图4 所示，鞭毛缺失菌株(△flhD)的生物膜形成能力显著低于WT 菌株；甚至低于△surA 菌株的生物膜形成能力。考虑到我们已经证明伤寒沙门菌surA 基因缺陷下调鞭毛相关基因表达，因此伤寒沙门菌surA 基因缺陷可能通过下调鞭毛基因表达来影响生物膜形成。

3 讨 论

细菌生物膜形成大致可分为3 个阶段：(1)早期黏附阶段，细菌游动聚集到有机或无机物表面，依赖鞭毛和菌毛相互黏附或黏附在固着物表面[15]；(2)中期细菌聚集群落形成，细菌开始分泌Curli 菌毛、纤维素、克拉酸、Bap 蛋白和胞外核酸等胞外基质，这些胞外基质堆积在细菌鞭毛和菌毛构建的“脚手架”样细菌群落上[16-18]；(3)晚期为生物膜成熟期，更多的细菌和胞外基质黏附在一起，生物膜厚度和体积越来越大，内部营养和氧气也越来越匮乏，细菌处于“休眠”状态，这些细菌为了节约能量，几乎不表达鞭毛等器官。处于生物膜表面的少量细菌受外部营养物或氧气的“引诱”，开始脱离生物膜，重新成为浮游生长的细菌[19]。生物膜形成早期依赖鞭毛的表达；生物膜中晚期细菌鞭毛低表达。鞭毛高表达促进早期生物膜形成，鞭毛高表达后运动能力增强又增加了生物膜的消散，那么总体上鞭毛对于细菌生物膜形成是“利”还是“弊”呢？我们发现伤寒沙门菌缺失鞭毛一级调控子基因flhD 后，细菌几乎全部丧失形成生物膜的能力，因此推测鞭毛对于生物膜形成是必不可少的基质。

SurA 主要作用是运送和组装外膜β-片层蛋白从胞浆通过周质到达外膜，与外膜组装蛋白协同作用，形成外膜蛋白，因此surA 基因缺陷后可能会导致外膜损伤。E.coli 中，周质中错误折叠的外膜蛋白堆积，导致诱导RpoE 介导的压力反应，而RpoE 介导的压力反应上调细菌的鞭毛表达[20]，这与本研究结果surA 基因缺陷后上调鞭毛表达结果相反，因此surA 基因缺陷上调鞭毛表达必然不是通过RpoE 介导的通路。外膜损伤可激活双组份系统Rcs 活化[21]，活化的Rcs 系统负调控鞭毛表达[22]，那么surA 基因缺陷后，是否能激活Rcs 系统活化？这种假设需进一步证明。

周质伴侣蛋白SurA 功能具有多效性，其对于外膜蛋白的正确折叠及组装是必不可少的，且可影响自转运黏附素Ag43 和菌毛的生成，SurA 还影响大肠埃希菌属，沙门菌属和志贺菌属生物膜形成和致病性。此外，鉴于SurA 的高度保守性，SurA 可能在其他革兰阴性细菌中扮演相似的角色。因此，未来SurA 有可能成为针对革兰阴性病原体有价值的药物靶标。