埃博拉病毒疫苗相关专利技术分析

王雨方 李鹤群

(国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津 300300)

一、引言

1.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)，在电子显微镜下呈纤维状“U”、“6”字形缠绕、成环或分枝，病毒粒子的长度一般在800纳米左右，不过有部分种类的长度可达1000纳米甚至更高[1]。该科有两个重要的属即马尔堡病病毒属(Marburgvirus)和埃博拉病毒属(Ebolavirus)。马尔堡病毒被分成单独的一类，而埃博拉病毒(图1)目前为止至少可以分为5亚型，分别是扎伊尔埃博拉病毒(1976)、苏丹埃博拉病毒(1976)、雷斯顿埃博拉病毒(1989)、科特迪瓦埃博拉病毒(1994)和本迪布焦埃博拉病毒(2007)，其中扎伊尔型、苏丹型和本迪布焦型对人类有高度致病性，科特迪瓦型因记载只有一位感染者而且康复所以没有计算致病性，雷斯顿型对人无致病性。马尔堡病毒的形态结构与埃博拉几乎一样，但是两者的抗原抗体反应不同，作为一种结构相近的病毒，通常将他们放在一起研究[1-4]。

图1 埃博拉病毒结构(最外层的“病毒包膜”是一种脂质双层结构)

1.2 埃博拉病毒疫苗

埃博拉病毒发现至今已经38年，然而仍然没有有效疫苗上市。每次疫情暴发之后关于抗埃博拉药物和疫苗的研究才引起人们的重视。以前大部分疫苗研究仅仅停留在动物试验阶段，最前沿的是非人类灵长类动物实验。2014年西非疫情大暴发后，世界各国都投入大量经费、集结大批科研人员展开了对埃博拉疫苗和药物的研究。在疫苗研究方面，美国和加拿大率先研发的疫苗已经应用于临床，在其他国家包括中国相关研究也取得了阶段性进展。

为了研究埃博拉疫苗的专利技术的发展情况，结合实际审查工作经验，笔者通过较为准确的关键词，充分使用追踪检索、块检索、转库检索等检索策略，结合算符命令以确保检索的全面性以及准确性，获取初步检索结果，依次浏览将明显噪音专利剔除，得到标准样本后，利用S系统的统计命令、Incopat专利分析数据库和Excel对该领域的全球专利申请数据和中国专利申请数据进行统计分析。本次专利分析以关键词和IPC分类号为主，对EBOV疫苗相关分类号的检索范围进行检索，检索关键词为：“埃博拉”(伊波拉、依波拉、埃波拉)，Ebola，EBOV，疫苗；分类号为A61K39+，检索数据包括截止到2019年05月14日公开的专利申请。

对获得的数据进行分析，本文主要在专利宏观分析后对专利技术发展脉络进行了进一步分析，得出目前针对EBOV的专利的关注技术点。

二、技术发展脉络分析

疫苗的接种为传染病常规的防控手段，但目前没有上市的埃博拉病毒疫苗，其原因是该病发病稀少且受地域局限，研发疫苗缺少经济价值而无法引起疫苗研发企业的重视。但多个实验室已在前期研究中取得了较好的进展，尤其在非人灵长类动物上可以获得快速、有效的保护，为此次防控奠定了基础。世界各地的科学家们采用多种途径进行埃博拉病毒疫苗的研发，其中包括灭活疫苗、反向遗传改造的复制缺陷型疫苗、病毒样颗粒疫苗、牛痘病毒载体疫苗、人3型副流感病毒载体疫苗、新城疫载体疫苗、狂犬病毒载体疫苗、委内瑞拉马脑炎病毒载体疫苗、DNA疫苗、水疱性口炎病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗。其中DNA疫苗和人5型腺病毒载体(rAd5)疫苗已完成了Ⅰ期临床试验证明了其安全性，但尚存一些不足需要完善。

2.1 埃博拉疫苗的分类技术发展脉络分析

根据埃博拉疫苗的抗原表位的制备分类，主要分为基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗。本文就基因工程亚单位疫苗这个技术分支进行技术发展脉络分析，其总体技术发展脉络图如图2所示。

图2 埃博拉疫苗技术发展脉络

根据上文所述埃博拉疫苗的抗原表位的制备分类分别就上述两个技术分支进行重点专利详述，其中重点专利的总体分布状况如表1所示。

表1 埃博拉病毒基因工程亚单位疫苗重点专利总体分布

2.2 基因工程亚单位疫苗

2.2.1 病毒样颗粒(VLP)

GROGAN CASE C等人于2002年1月31日在美国申请的公开号为US20030108560A1号专利公开了一种生产嵌合丝病毒GP蛋白的方法，包含gp1和gp2的嵌合丝状病毒gp蛋白，其中所述gp1选自与gp2不同的丝状病毒。GP1来自埃博拉，GP2来自马尔堡。所述嵌合GP是在SEQ ID NO：2及其保守取代物中鉴定的EBGP1/MBGP2。嵌合GP是在SEQ ID NO：8中鉴定的RVNGP1/MUSGP2及其保守取代物。

LI LIMIN于2003年10月1日在美国申请公开号为US20040223972A1的专利，其公开了一种抗体结合的N-末端或C-末端区域的所述tsg101蛋白的方法，其中所述哺乳动物细胞为人类细胞。所述抗体结合的表位包括在选自组成的组的氨基酸区域的vretvnvitlykdlkpvl(SEQID NO：2)和qlralmqkarktaglsdly(SEQ ID NO：3)。

中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所于2017年3月13日在中国申请专利CN106868025A，公开了一种用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法该方法包括如下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体(缺失了黏蛋白样区域和C-端穿膜区的埃博拉病毒糖蛋白)的基因导入受体酵母细胞中，得到重组酵母细胞；2)对重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得埃博拉病毒糖蛋白突变体。用本发明制备的埃博拉病毒糖蛋白突变体所制备的埃博拉出血热预防用疫苗，可诱导小鼠产生显著的针对埃博拉病毒糖蛋白的抗体滴度。本发明具有工程菌株构建、培养周期短、培养条件简单、成本低、适于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可进行蛋白质翻译后修饰加工等典型特点，适合在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。

2.2.2 非病毒样颗粒

中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所于2014年3月4日在中国申请的CN103864904A号专利公开了暴露于GP蛋白表面的中部区域(aa393-556)在GP蛋白功能的发挥中具有关键作用，且该区域含有丰富的GP蛋白抗原表位。本发明提供的抗原片段是来自埃博拉病毒(Zaire)包膜蛋白GP的一段序列(aa393-556)以及该序列的截短体。本发明提供的抗原片段L具有作为GP蛋白相似的抗原潜力，免疫产生的中和抗体能够有效抑制病毒的感染。与完整的GP蛋白抗原相比，该抗原片段不具有GP蛋白的生物学功能(不具有GP1亚基与GP2亚基的功能，在病毒进入过程中只发挥辅助功能)，因此不能使病毒进入宿主细胞，该片段用于病毒载体疫苗的构建时具有更好的安全性，也更方便用于多价疫苗制备。抗原片段L进一步截短后也能够诱导较强的体液免疫反应，具有良好的免疫原性，可应用于埃博拉病毒疫苗的开发及中和抗体的制备。pVAX1载体组的实验结果与生理盐水1组的实验结果无显著性差异。抗原L能够有效诱导中和抗体的产生，对假病毒感染细胞的中和能力与抗原GP相当。抗原L的三个截短体LA、LB及LM也能不同程度地抑制假病毒的感染，即三个截短体也能够产生不同水平的中和抗体。

MICROVAX公司于2016年11月2日在美国提出专利申请：US9889188B1公开了三种肽主要结合抗体并且来自相同的GP1蛋白，并且它们各自相对较短(每个长度约16个氨基酸)。这三种肽与ecdCD40L融合在一起作为第一种组合物和/或疫苗的一部分，而SEQ ID NO.4与ecdCD40L分开融合，作为第二种组合物和/或疫苗，它是一种相对较长的氨基酸列表。60个氨基酸，主要含有细胞受体的接触位点。当在病毒攻击前24小时施用100微克抗体时，结合这些肽的每种抗体将保护小鼠免受致命的埃博拉攻击。随着抗体剂量降至25微克，受保护小鼠的百分比降低。与肽2(SEQ ID NO.2)结合的抗体中和埃博拉病毒的感染性，而与肽1和3(SEQ ID NO：1和3)结合的抗体则没有。尽管与肽1-3(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)结合的抗体可以结合来自Zaire的两种埃博拉菌株的GP1，但它们不结合来自象牙海岸或苏丹的埃博拉病毒株。衍生这3种肽的GP1区域在埃博拉病毒株中保守性差，并且在可溶性形式的GP1中不是任何区域共有的。基于这些肽被埃博拉的中和抗体识别，提出肽1-3(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)与ecdCD40L连接以产生组合物和/或疫苗。

三、总结与展望

基因工程亚单位疫苗中病毒样颗粒疫苗的研究开始较早，病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是单独由病毒衣壳蛋白或与囊膜蛋白共同自主包装形成的空衣壳结构，VLPs能够模拟天然病毒粒子，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。而且病毒样颗粒不含有核酸遗传物质，安全性好。由于VLPs疫苗比传统灭活和减毒活疫苗更加安全有效，因此已被用于多种疾病疫苗的研究。埃博拉VLPs疫苗要真正实际应用，还要解决其生产的问题，由于前期研究的VLPs均由293T生产，无法满足大量生产。埃博拉VLPs疫苗较载体疫苗更为安全，如果能够进一步提高其免疫原性，缩短免疫周期，其有望成为最有潜力的埃博拉疫苗。

综上，基因工程亚单位疫苗仍是研究的主体方向，由于基因工程亚单位疫苗较传统亚单位疫苗免疫效果较差，因此在保证毒性更小更安全的前提下，找寻疫苗免疫原性更强的抗原基因及其修饰位点仍是主要研究方向。并且可从调整基因组合入手，联合具有靶向免疫增强等功能性的新型载体佐剂而制备出更安全有效的疫苗。