微RNA参与PCI后心肌缺血再灌注损伤防治的研究进展

李童，李学文，米小龙

(1.山西医科大学，太原 030000； 2.山西白求恩医院心内科，太原 030000)

目前急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)仍是导致我国居民死亡和残疾的主要病因之一。溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)能及时对缺血心肌进行再灌注，从而限制心肌梗死面积，保持左心收缩功能，降低患者死亡率，是急性ST段抬高型心肌梗死 (ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)最有效的治疗方法。尽管如此，AMI的发病率和死亡率仍然较高，5%～10%的患者仍会在PCI后1～2年发生不良心血管事件，研究人员将此归咎于心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。即使再成功的PCI也会导致MIRI发生，目前临床尚无有效方法预防心肌梗死PCI后MIRI。因此关于术后MIRI的防治成为近些年来心血管领域研究的热点。过去再灌注损伤的心脏保护疗法包括使用抗氧化剂、钙通道抑制剂以及清除炎症因子等，但其应用于临床的效果并不好。对MIRI潜在的病理生理机制的研究先后催生出缺血预处理、缺血后处理、远程缺血预处理和相关药物治疗等策略，许多策略已在实验室证明有效，部分在临床应用中表现良好。体内微RNA(microRNA，miRNA)可能是上述治疗策略中发挥作用的重要介质和效应分子。现就miRNA参与缺血再灌注损伤后不同类型心肌保护的机制做一综述。

1 miRNA概述

miRNA是一类广泛存在于真核生物体内的高度保守的非编码基因序列，其5′端有磷酸基团，3′端有羟基结构，长度为17～25个核苷酸，其典型特征是具有发夹结构。1993年，Lee等[2]在线虫体内首次发现能阶段性调控胚胎后期发育的基因lin-4，开启了人类对miRNA认识的大门。在真核细胞中，miRNA的形成过程首先是RNA聚合酶Ⅱ从 miRNA编码基因转录出原始miRNA，长度为300～1 000个碱基；经核酸内切酶ⅢDrosha的加工后，切割成长度为70～100个碱基、具有茎环结构的前体miRNA；前体miRNA转运至细胞质后，由Dicer酶切成长度为17～25个核苷酸大小的成熟双链miRNA；最后在解螺旋酶的作用下，双链miRNA解开，其中一条链被降解，另一条链形成RNA诱导沉默复合体，通过作用于与其部分或完全互补的下游靶mRNA，使下游靶mRNA的表达下降或降解，从而调控体内基因表达。miRNA在血浆中能稳定存在且形式多样，其既能与蛋白质结合，包括脂蛋白如高密度脂蛋白，核糖核蛋白如Ago蛋白；又能包裹在囊泡中以胞外囊泡的形式存在。miRNA根据细胞来源可分为外泌体、微囊泡及凋亡小体[3]。研究发现，miRNA在心脏的多种生理和病理过程中发挥作用，包括心肌梗死、心肌肥厚、心肌纤维化、心律失常、心力衰竭[4-5]。

2 miRNA与缺血预适应

缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)是指在一次长时间致命性心肌缺血发作前，人为造成多次短时间的非致死性缺血再灌注，进而诱导机体产生内源性物质保护心肌，这一现象由Murry等[6]首次发现。随后在不同种属动物以及不同组织器官中证实了IPC的心肌保护效应，包括减小心肌梗死面积、降低再灌注心律失常发生率、改善缺血后内皮功能失调。Staat等[7]研究表明，IPC能显著减小心肌梗死面积。IPC本身即是一种有创的治疗方法，且仅适用于缺血事件发生前，但AMI通常很难预料，因此IPC很难运用到临床。多种miRNA参与了IPC减轻MIRI的机制。Varga等[8]的研究首次揭示了行缺血预处理后MIRI早期机体内miRNA的变化，该研究将大鼠分为三组，即非缺血组，缺血再灌注组(冠状动脉缺血30 min，再灌注120 min)和缺血预处理组(缺血再灌注前先短暂缺血5 min，再灌注 5 min，往复3次)，通过微阵列分析发现，缺血预处理组中有3种miRNA(miR-139-5p、miR-192和miR-212)的表达水平与缺血再灌注组和非缺血组相比显著上调，表明这些miRNA是由IPC特异性诱导的。此外，该研究还发现miR-487b在缺血再灌注组显著上调，而IPC抑制了上调，从而证明IPC在MIRI中不仅能促进心脏保护性miRNA的表达，也能特异性抑制损伤性miRNA的表达。Cheng等[9]发现，MIRI前24 h注射antigomiR-21抑制miR-21的表达能抵消IPC的心肌保护作用。Wang等[10]研究发现，缺乏miR-451的小鼠对IPC作用不敏感，通过注射antigomiR-451能明显改善这一现象。

3 miRNA与缺血后适应

随着对MIRI研究的深入和病理生理过程的了解，发现了一种新的减轻MIRI的方法——缺血后适应。虽然相较于IPC，缺血后适应仍是一种有创的治疗手段，其是在心肌缺血发生后再灌注治疗开始前，实施多次短暂的缺血再灌注处理。Staat等[7]将30例急性STEMI患者分为缺血后适应组和对照组，患者均行PCI治疗，缺血后适应组患者行支架置入后行4个循环的短暂缺血再灌注(球囊扩张1 min，恢复血液灌注1 min)治疗。结果发现，缺血后适应组患者心肌梗死面积缩小36%，且患者的心肌灌注分级也显著高于对照组。

目前关于调控缺血后适应的miRNA在心脏保护中的确切作用尚不清楚。miR-499是由肌球蛋白重链7B编码的miRNA，仅在心肌细胞内表达[11]。Zhu等[12]采用基因芯片微阵列分析发现，缺血后适应组与缺血再灌注组有23种miRNA上调，33种miRNA下调，其中miR-499上调最显著，是缺血再灌注组的8倍多。为确定miR-499的心肌保护作用，向小鼠冠状动脉内注射antagomiR-499以拮抗内源性miR-499的表达，然后与缺血后适应组相比发现，心肌梗死面积显著扩大；荧光素酶报告基因检测显示miR-499会直接抑制程序性细胞死亡因子(programmed cell death factor，PDCD)4的翻译，证明PDCD4是miR-499的直接靶点[12]。Wan等[13]发现，与缺血再灌注组相比，缺血后适应组的心肌梗死面积占缺血面积的比例下降，表明缺血后适应可改善心肌功能，减小心肌梗死面积，预防缺血再灌注损伤。进一步研究发现，缺血后适应组miR-214的表达水平显著上调、缺氧诱导因子-1α抑制因子表达水平下调，认为miR-214可能通过靶向调控缺氧诱导因子-1α抑制因子基因参与缺血后适应的保护作用[13]。也有研究报道，心肌特异性较好的miR-1、miR-133参与了缺血后细胞凋亡进程，两者在调控细胞凋亡上相互拮抗，心肌缺血后过表达的miR-1可抑制热激蛋白60和热激蛋白70的表达，进而促使心肌细胞凋亡，而转染miR-133可部分阻止心肌细胞的凋亡，其机制可能是miR-133可在多种层面抑制胱天蛋白酶-9的表达[14-15]。He等[16]的研究也表明，缺血后适应通过上调miR-133a的表达，减少心肌细胞凋亡，具体机制可能是miR-133a通过靶向抑制胱天蛋白酶-9的表达，减少心肌细胞凋亡。目前认为miR-21能调控细胞凋亡，属于抗凋亡基因，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因和PDCD4是其主要靶点[17]。Tu等[18]研究证实，miR-21能通过人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源/蛋白激酶B信号通路参与缺血后适应介导的心肌保护，抵抗MIRI和功能障碍。

4 miRNA与远端IPC

远端IPC(remote ischemic preconditioning，RIPC)是通过在肢体远端诱导一个或多个短暂非致命的缺血和再灌注循环，从而远距离保护心脏免受急性心肌缺血再灌注的影响[19]，其通过干预非重要器官达到降低心肌损伤的目的，是一种可行、无创、有效的心肌保护方法，与IPC相比更具临床应用价值。一般通过使用绑在四肢的血压袖带完成充气和放气3个 5 min的缺血再灌注循环，即可实现心肌保护作用。RIPC可以预防缺血引起的心肌组织线粒体呼吸功能损伤，减少活性氧类的产生，维持腺苷三磷酸水平，从而减少心肌缺血缺氧损伤[20]。虽然目前大规模临床研究并未证明RIPC对心肌的保护效应[21]，但一些单中心研究发现，应用RIPC可减少PCI后心脏坏死标志物的释放，减轻再灌注损伤[22-23]。Bøtker等[24]发现，在转运途中对STEMI患者实施RIPC可显著改善心肌存活，且仅有一支冠状动脉闭塞的患者从该治疗性干预措施中获益最大。为研究RIPC保护心肌的内在机制，Slagsvold等[25]将60例冠状动脉旁路移植术患者随机分为RIPC组(30例)和对照组(30例)，RIPC组患者术前将上臂血压袖带充气至200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，持续5 min，后放气5 min，如此往复3个循环后手术，术后右心耳处活检测量最大线粒体呼吸商发现，RIPC组术前、术后最大线粒体呼吸商保持不变，而对照组下降28%，提示RIPC能显著保护再灌注心肌组织；通过定量逆转录聚合酶链反应检测miRNA的表达情况发现，RIPC组miR-1的表达下调，而对照组miR-1显著上调，认为RIPC可能是通过抑制右心房心肌miR-1的表达，改善线粒体呼吸功能，减少心肌缺血缺氧损伤。国内有学者将165例冠心病患者随机分为试验组和对照组，试验组患者于入院后第2、3、4天上午、下午各进行1次RIPC治疗，所有患者于入院第5天行择期PCI，测定入院第2天和第5天miR-21的表达情况发现，两组患者入院后第2天血浆miR-21的水平比较差异无统计学意义，而第5天血浆miR-21的水平比较差异有统计学意义，其中试验组第5天血浆miR-21的水平较第2天明显上升，而对照组则无明显变化，据此认为RIPC能上调冠心病患者血浆miR-21的水平，减轻冠状动脉再灌注损伤程度[26]。

5 miRNA参与药物相关的心脏保护机制

MIRI在围手术期发生频繁，包括心脏和非心脏手术，可导致心肌细胞凋亡和坏死，是围手术期死亡的重要原因。阿片类药物作为围手术期镇痛方案的一个组成部分，无论是在全身麻醉期间还是局部使用阿片类药物预处理和后处理对心脏均有强大的保护作用[27]。将分离的成年大鼠心肌细胞按不同处理方法分为空白对照组，缺氧再灌注组和吗啡处理组，结果显示，缺氧再灌注组细胞损伤严重，与对照组相比心肌细胞活力明显降低，乳酸脱氢酶水平和细胞死亡数增加，而吗啡能显著保护心肌细胞免受缺氧再灌注损伤，细胞活力提高，乳酸脱氢酶水平和细胞死亡数降低；微阵列分析显示，吗啡处理组miR-133b-5p的表达明显上调，双荧光素基因报告证实Fas是miR-133b-5p的下游靶基因；将miR-133b-5p模拟物或抑制剂分别转染心肌H9C2细胞，证明miR-133b-5p通过抑制Fas基因的表达，在吗啡介导的心肌保护作用中发挥重要作用[28]。除阿片类药物外，心脏保护药还包括调节再灌注损伤细胞信号通路的药物，如腺苷、心房钠尿肽、阿托伐他汀、促红细胞生成素、艾塞那肽、极化液等。PCI后3 h内静脉滴注腺苷可能对STEMI患者临床预后有有益作用[29-30]。环孢霉素A可通过抑制线粒体膜通透性转换孔的开放而发挥心肌保护效应[31]，后者是介导致死性缺血再灌注损伤的关键因素。一项临床研究显示，STEMI患者行PCI前予以静脉注射环孢霉素A可明显减小心肌梗死面积，减少心室重构等不良反应[32]。目前关于使用上述药物后体内miRNA表达情况的研究较少，未来可进一步针对药物对体内miRNA表达的影响进行研究。

6 展 望

尽管直接PCI和溶栓等方法能够早日实现急性STEMI相关血管的再灌注，但MIRI仍是影响急性STEMI患者血运重建获益的重要因素。针对PCI后MIRI防治的研究已从机械治疗策略如缺血预处理、缺血后处理、远端缺血预处理和相关药物治疗策略发展至调控机体内源性小分子物质如腺苷、肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1、热激蛋白70、线粒体乙醛脱氢酶2等的表达[33]，随着时间的推移，越来越多新的MIRI和心脏保护靶点正在被确定。近年来miRNA在MIRI和心脏保护方面的价值已引起人们的关注，许多已被证明是心脏病的生物标志物或用于预防心肌梗死、心力衰竭的潜在治疗靶点。通过上调或下调相应miRNA的表达能起到心肌保护的效果。不同治疗策略引起体内miRNA的表达趋势也不相同，同一种心肌保护方法也能引起不同种类miRNA表达水平的改变，且一种miRNA通常有多个下游靶点，正是miRNA的这些特点使得有望改善AMI患者的预后。

miRNA真正用于临床实践还存在一些困难，一方面是目前研究的与MIRI相关的miRNA心肌特异性不高；另一方面目前仅有极少部分的实验室结果与临床试验结果一致，原因可能是不恰当的实验动物模型、不确定疗法的临床测试以及不恰当的临床试验设计。现阶段正在进行以纳米颗粒、病毒和外泌体作为载体的研究，以改善miRNA的组织特异性，并提高心肌对miRNA的生物利用度，以促进临床成果转化。相信随着对MIRI机制研究的深入及相关临床试验的开展，有望找到可有效防治MIRI的miRNA，最大化再灌注治疗的获益，改善AMI患者的预后。