绿原酸对慢性胆汁淤积所致大鼠肝纤维化模型胆管及胶原增生的影响

唐丽明， 李婉华， 宋 宁， 张桂贤， 刘大卫

慢性胆汁淤积是由多种肝脏疾病引起胆汁流形成、分泌和排泄障碍的一种病理状态。长期慢性胆汁淤积可导致肝内慢性炎症反应、胆管细胞和肝细胞渐进性破坏，并诱发胆管反应，激活肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)并使之过度增生，分泌过量胶原，并逐步进展为肝纤维化、胆汁性肝硬化和终末期肝病[1-3]。绿原酸(chlorogenic acid)是茵陈的主要有效成分之一，属于苯丙素类化合物，具有广泛的药理作用，特别是具有确切的保肝利胆作用[4]。文献报道，绿原酸对多种动物肝损伤模型均有显著保护作用，例如具有减轻肝损伤和消除黄疸作用[5-6]。

本实验通过α-异硫氰酸萘酯（ANIT）多次灌胃给药制备慢性胆汁淤积大鼠肝纤维化模型，应用高、低剂量绿原酸进行预防给药，旨在观察绿原酸对慢性胆汁淤积模型大鼠胆汁淤积、胆管增生及胶原增生等病理改变的影响，探索其具体防治机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康成年SPF级Wistar大鼠40只, 雄性，体质量（220±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号11400700330105。

1.2 主要试剂与仪器 α-ANIT购于美国Alfa Aesar公司；熊去氧胆酸（UDCA）购于德国Dr.Falk公司；绿原酸购于美国Sigma公司；天狼星红-苦味酸染液购于北京索莱宝公司；α-SMA抗体购于美国Abcam公司。EG1150H型包埋机、RM2235/2245切片机、ASP300脱水机、DM400B正置显微镜及DM750P型偏振光显微镜均为德国Leica公司产品，TBA2000-FR全自动生化分析仪为日本东芝公司产品。

1.3 动物分组、造模及给药方法 将40只大鼠随机分为5组：对照组、模型组、UDCA组、绿原酸低剂量组和绿原酸高剂量组，每组8只。除对照组外，其余各组以ANIT（80 mg/kg）灌胃5周，每周3次，制备慢性胆汁淤积模型，同时UDCA组、绿原酸低剂量组和绿原酸高剂量组，分别给予UDCA（90 mg/Kg）、绿原酸（50 mg/Kg和100 mg/Kg）灌胃，每日1次，连续5周。ANIT以食用植物油溶解，均为每日给药前配置。

1.4 标本采集及处理 5周实验结束后，将大鼠用3%戊巴比妥麻醉后开腹，经腹主动脉取血，制备血清。取部分肝组织用中性甲醛固定，另取部分肝组织液氮冻存。

1.5 检测指标

1.5.1 大鼠血清肝功能检测 采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中TBIL、DBIL、IBIL、ALP水平。

1.5.2 大鼠肝组织HE染色 将经10%中性福尔马林固定的肝组织，常规石蜡包埋, 4 μm厚连续切片, HE染色，普通光学显微镜下观察、摄片。

1.5.3 大鼠肝组织天狼星红-苦味酸染色及胶原表达定量分析 病理切片经脱蜡处理，以0.1%（W/V）天狼星红-饱和苦味酸溶液在室温下染色1h，蒸馏水冲洗、Mayer苏木精复染和1%盐酸分化，蒸馏水碱化后脱水、封片。将染色后切片在偏振光显微镜下观察、摄片。在偏振光照射下，I型胶原蛋白显示为黄红色，Ⅲ型胶原显示为绿色。采用Image-Pro Plus 6图像分析软件计算胶原荧光平均积分光密度（integrated optical density, IOD）值。

1.5.4 Western blot 检测肝组织α-SMA表达 定量称取肝组织加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，冰浴下组织匀浆，15000 r/min，4℃离心10 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量，SDA-PAGE电泳分离，转膜，5% BSA封闭，分别孵育一抗抗体α- SMA（1:1000）及 α-tubulin（1:5000）4℃过夜，洗膜，室温下分别孵育羊抗兔二抗（1:8000）、羊抗鼠二抗（1:1000）1 h，洗膜，加入ECL发光液于化学发光分析仪中曝光。以α-tubulin为标准化参考物，采用Image J软件测量各条带灰度值，定量分析α-SMA蛋白谱带的相对强度。

2 结果

2.1 各组大鼠血清肝功能指标结果 与对照组比，模型组大鼠血清中TBIL、DBIL、IBIL、ALP水平均显著升高（均P＜0.01），显示慢性胆汁淤积造成肝功能损伤；与模型组比，绿原酸高、低剂量组以及UDCA组血清TBIL、DBIL、IBIL水平显著降低（P＜0.05），ALP有下降趋势，但差异无显著性（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清肝功能指数比较

2.2 各组大鼠肝组织病理组织学观察 光镜下观察显示，对照组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，呈放射状，无炎性细胞浸润，肝细胞无变形和坏死，汇管区正常，无胆管及纤维增生；模型组显示肝细胞索排列紊乱、模糊，汇管区慢性炎性细胞浸润明显，汇管区胆管增生、扩张显著；绿原酸高、低剂量组及UDCA组肝慢性炎性反应及汇管区胆管增生反应显著减轻，见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理组织学结果（HE，×100）

2.3 大鼠肝组织天狼星红-苦味酸染色及胶原定量结果 天狼星红-苦味酸染色显示，正常组大鼠肝组织胶原表达稀少，而模型组汇管区胶原表达显著增强，偏振光下以亮红黄色的粗纤维状I型胶原为主；与模型组比，绿原酸高、低剂量组以及UDCA组肝组织胶原染色显著均减轻，偏振光下以呈绿色的细纤维状III型胶原为主。胶原荧光定量结果显示，模型组IOD值（3452. 8±437.2）显著高于对照组（21.3±5.8）（P＜0.001）；与模型组比，绿原酸高剂量组（467.2±95.4）、低剂量组（401.7±55.6）以 及UDCA组（1145.6±137.5）IOD值显著降低（均P＜0.01），见图2、图3。

图2 大鼠肝组织胶原表达结果

图3 各组大鼠肝组织天狼星红-苦味酸染色偏振光下荧光IOD值

2.4 各组大鼠肝组织α-SMA表达结果 Western blot法检测结果显示，模型组大鼠肝组织中α-SMA表达水平（1.07±0.06 ）较对照组（0.46±0.03）显著升高（P＜0.01），与模型组比，绿原酸高剂量组（0.68±0.11）、低剂量组（0.76±0.10）以及UDCA组（0.65±0.08）肝组织α-SMA表达显著降低（均P＜0.05），见图4、图5。

图4 大鼠肝组织中α-SMA的Western blot表达

图5 各组大鼠肝组织中α-SMA蛋白表达相对强度比较

3 讨论

慢性胆汁淤积病因多样，发病机制复杂，但无论何种病因，胆汁淤积如得不到有效治疗，几乎都将序贯性地引起肝纤维化，最终导致不可逆性肝硬化[7]。

目前认为慢性胆汁淤积导致肝纤维化的发生机制为：长期胆汁淤积损伤胆管细胞，引起汇管区慢性炎性反应，大量炎症细胞浸润，释放大量生长因子、细胞因子、化学因子等，促进肝星状细胞大量增殖、活化，后者继而转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)，分泌大量胶原及其他细胞外基质（ECM）成分并集中沉积于汇管区胆管周围[3,8-9]。 随着疾病进展，胆汁淤积也会造成进行性肝细胞损伤，进一步加重炎性浸润和扩大纤维化范围。在这一病理进展过程中，胆汁淤积诱发胆管反应及汇管区周围胆管增生是一个非常有特点的重要病理环节。本研究采用ANIT多次灌胃给药制备慢性胆汁淤积大鼠模型，HE病理染色观察发现，模型组大鼠肝组织汇管区慢性炎性细胞浸润明显，小胆管大量增生、扩张，增殖的胆管周围大量胶原蛋白沉积,与文献报道结果类似。文献报导认为ANIT主要通过靶向损伤小胆管上皮细胞，破坏其排泄功能，导致肝内胆汁淤积，并引起胆小管增生及小叶间胆管周围炎症，造成肝内胆管阻塞，从而形成明显的胆汁淤积，因而能较好模拟临床慢性肝内胆汁淤积的病理变化[10-12]。

本研究进一步采用天狼星红-苦味酸染色法重点对肝组织汇管区增生、沉积的胶原蛋白及其类型进行了观察和分析。目前认为肝纤维化时有5种主要胶原蛋白参与, 其中以Ⅰ、Ⅲ型为主, 肝纤维化早期以Ⅲ型为主, 后期以I型为主，并且在肝纤维化过程中I、Ⅲ型胶原是假小叶纤维间隔的重要来源,即I、Ⅲ型胶原是肝纤维化、肝硬化时肝ECM的主要成分[13]。天狼星红-苦味酸染色在偏振光照射下，I型胶原蛋白呈红、黄色的粗纤维状，而Ⅲ型胶原则呈现为绿色的细纤维状[14]。本研究发现，模型组大鼠肝组织汇管区胶原荧光表达显著增强，偏振光下以亮红、黄色的I型胶原为主，绿色的Ⅲ型胶原表达非常微弱，显示已发生肝纤维化。

针对慢性胆汁淤积激活的肝星状细胞[15]，本研究应用其特征标志分子α-SMA，采用Western blot法进行检测，结果显示，与对照组比，模型组大鼠肝组织中α-SMA表达水平显著增强，提示肝星状细胞显著激活，与胶原表达的增强相一致。

绿原酸即1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸-(3，4-二羟基肉桂酸酯)，多项研究显示其具有显著的抗炎、保肝、利胆、抗氧化等作用。文献报道，绿原酸对四氯化碳(CCI4)肝损伤、阻塞性黄疸以及脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤均有较好的保护作用[6]。本实验应用高、低剂量绿原酸对ANIT所致慢性胆汁淤积大鼠肝纤维化模型进行预防给药，结果发现高、低两个剂量的绿原酸均可显著改善肝功能，表现为血清TBIL、DBIL、IBIL水平显著降低，另外，ALP也有下降趋势，但差异未达显著性，考虑原因有可能与本次每组动物样本量（8只）稍小有关。高、低剂量绿原酸还显著减轻了肝组织的慢性炎性反应及汇管区胆管增生反应，肝组织胶原染色均显著减轻，偏振光下以呈绿色的III型胶原为主，显示肝纤维化程度及进程被显著抑制；绿原酸高、低剂量组大鼠肝组织α-SMA表达也显著降低，提示绿原酸可显著抑制肝星状细胞的活化。在研究中也发现，绿原酸高、低两个剂量间的差异，高剂量呈更好的疗效趋势，但两个剂量组相比，差异未达到显著性，分析原因，一是可能是药效实验中的天花板效应（ceiling effect）（即指当增加药物剂量时相对应的生物学效应如药效、毒性等不会随着剂量的增加而增加），二是可能由于剂量还有提高的空间，三是可能与动物样本量略小（每组8只）有关，这个不足将在接下来的研究工作中加以完善。

综上所述，绿原酸可显著改善ANIT诱导的慢性胆汁淤积大鼠模型的肝功能损伤、有效抑制肝星状细胞活化、减少以I型胶原为主的胶原产生、减轻慢性胆汁淤积所致的汇管区小胆管增生，从而发挥抗肝纤维化作用。本研究同时为慢性胆汁淤积致肝纤维化的机制研究以及探索利胆中药单体化合物的分子机制提供了实验依据。