重视呼吸道病毒感染的实验室检测

刘洋

（南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006）

急性呼吸道感染可引起多种临床疾病,每年造成约425 万人死亡,已成为人类第三大常见疾病[1]。其中病毒引起呼吸道感染约占急性呼吸道感染的70~80%[2]。尽管细菌以前被认为是呼吸道感染的主要病原，但细菌感染常可通过培养、诊断标志物检测等诊断，而病毒则很难在临床条件培养，且存在标志物少、诊断窗口期短等缺点，导致病毒感染一直被临床低估及忽视。近年来，随着各种呼吸道病毒感染疾病在世界范围内流行,呼吸道病毒感染被广受重视[3]。呼吸道病毒主要包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒和鼻病毒等[4]。其中流感和呼吸道合胞病毒每年可造成近30 万五岁以下的儿童死亡,而腺病毒和鼻病毒等发病率高和死亡率高[5,6]。特别是，几种具有潜在流行性特征的新发呼吸道病毒威胁全球,包括急性呼吸系统综合征-冠状病毒（SARS-CoV）、禽流感病毒 H5N1，H7 N9 和H10N8、甲型H3N2 流感病毒变种、猪源甲型HIN1 流感、人14 型腺病毒、新冠病毒(SARS-CoV-2)以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。目前对 SARS-CoV-2、MERS-CoV 和 H7N9 的发病机制和传播方式仍知之甚少,因此尽早作出病原学诊断直接影响对其治疗、干预和预防措施的实施。

近年来新检测技术和方法不断涌现并应用于临床，如核酸分子扩增、基因芯片、基因测序及质谱技术等。这些方法具有高通量、高敏感性、可同时检测多指标的特点,为病毒检测带来了技术上的革新，但也存在假阳性、假阴性率，以及受操作和临床多种因素影响等等。因此，在建立区分呼吸道病毒感染和呼吸道细菌感染方法同时,应规范标本的采集、储存、运输、检测过程，提高对呼吸道病毒感染标本检测效率和准确率。

1 重视区分呼吸道病毒感染和呼吸道细菌感染[7]

以临床症状、影像学及实验室检查诊断呼吸道病毒感染和呼吸道细菌感染是CAP （社区获得性肺炎）诊断的重要方式。流行病学研究显示，呼吸道细菌性感染在发生人群和体征上与呼吸道病毒感染存在差异。研究发现病毒性肺炎患者常有心脏病等并发症，且年龄较大[8]。Liu 等[9]报道病毒性肺炎导致更多的咳嗽和较少的胸膜疼痛，而Jennings 等[10]人发现肌痛通常与病毒性疾病有关的症状。影像学上，呼吸道细菌感染常与局灶性肺泡浸润相关,而呼吸道病毒感染常为双侧间质性肺部浸润。降钙素原等标志可作为病毒感染诊断的重要依据。降钙素原产生依赖于循环重肿瘤坏死因子的存在，而在病毒感染中，巨噬细胞产生的干扰素可抑制肿瘤坏死因子, 进而抑制降钙素原的升高。尽管呼吸道病毒感染与细菌感染存在一定差异,但目前仍难以准确区分。因此，准确有效的诊断方法对呼吸道病毒疾病的控制至关重要。

2 呼吸道病毒感染标本采集、运送、储存及预处理

2.1 呼吸道病毒感染标本的采集 正确采集标本是保证诊断准确性的前提。标本来源主要为呼吸道、血液及泌尿消化道，采集方法包括无创和有创方法，前者主要集中在部分呼吸道、泌尿及消化道标本上,对患者创伤小，易于接受，但易受定植菌群干扰。后者通过有创性操作，从正常状态下“相对无菌”的部位取材，对诊断的意义更大。针对不同种类呼吸道病毒感染标本采集如表1 所示。其中组织活检标本是呼吸道病毒感染确诊的金标准。

表1 呼吸道病毒感染标本种类及采集要求[11-16]

2.2 呼吸道病毒感染标本的运送与储存 呼吸道病毒感染标本运送和储存原则：⑴标本标签和申请单信息完整。标签应贴在容器上，而非容器盖上[17,18]。⑵采集尽量保持无菌操作，避免被污染。⑶所有标本采集后应在2h 内送检, 转送时间超过规定时间时应冷藏运送。小样本量标本应于采样后30分钟内送检，避免标本干涸。⑷保证必要的运送条件，对标本运送条件有不同要求。见表2。

3 呼吸道病毒实验室检测

3.1 病毒培养和鉴定 病毒分离培养一直是病毒鉴定的 “金标准”。常用培养细胞有人肺癌细胞A549、貂肺上皮细胞(MvlLu)、马丁达比犬肾细胞(Madin-Darbv canine kidnev, MDCK)。不同的病毒培养时间不同, 一般数日到2 周不等。以细胞病毒效应（CPE）作为确认病毒生长的观测指标，大多数病毒CPE 出现时间为5～10d。此法可以分离检测多种病毒，实现呼吸道病毒混合感染的诊断。此次新冠肺炎疫情中,我们也发现部分病例存在新冠病毒与流感病毒、呼吸道合胞病毒等混合感染[19]。病毒分离培养可用作抗病毒药物、疫苗研究、血清分型及流行病学研究等。但传统病毒细胞培养繁琐、费时，诊断效率低，临床应用受限。

表2 呼吸道病毒感染标本转运通用原则[18]

近年来，基于病毒培养金标准的特性，开发了改良后的病毒培养方法,如病毒离心培养法,基于低速离心增加病毒对培养细胞的感染性,目前已经应用在呼吸道病毒的培养中。也存在基于免疫学改良的病毒培养技术，如pre-CPE 技术，通过酶标或荧光标记的单克隆抗体在CPE 出现之前完成检测。也可采用混合细胞培养法，提升病毒检出率的同时，实现多种病毒同时检测。此外，还有转基因细胞培养法，通过特定基因转入细胞后，使得特定病毒转入细胞时产生易于测定的酶,提高病毒检出率及特异性。

3.2 呼吸道病毒直接抗原检测 采用免疫学手段，如酶联免疫检测（ELISA）、免疫层析、免疫荧光技术等，可检测流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多种病毒抗原[20,21]。常用标本类型为咽拭子、气管镜吸取物、BALF 和肺穿刺活检标本等。应用方便快捷，但灵敏度较差[22]。以呼吸道合胞病毒为例，ELISA 及免疫荧光技术是传统检测呼吸道合胞病毒, 其中以呼吸道合胞病毒F 蛋白为靶标的改良ELISA 技术可在25min 内完成，成本低廉。此外，还可以使用直接免疫荧光技术检测呼吸道合胞病毒，灵敏度和特异度分别高达94%和96.8%[23]。

3.3 呼吸道病毒抗体检测 采用免疫学手段，如酶联免疫检测、免疫层析检测、磁微粒化学发光技术等，可检测流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多种病毒血清抗体。免疫学方法检测呼吸道病毒抗体存在窗口期、假阳性等缺点，诊断滞后。如新冠病毒抗体检测时很容易因患者标本中存在内源性或外源性干扰物质（类风湿因子、补体、嗜异性抗体等）导致免疫测定假阳性，而抗体检测假阴性常又因发病早期抗体可能尚未出现,包被抗原质量对抗体检测的敏感性等造成。因此，呼吸道病毒抗体检测常常只作为呼吸道病毒感染诊断的补充手段。

3.4 呼吸道病毒核酸分子检测 核酸分子检测已成为呼吸道病毒感染诊断的重要手段。根据病毒基因序列可快速建立测定方法,快速应对传染病疫情对病原学诊断的需求,显著提高了呼吸道病毒感染检测的敏感性, 可在数小时内快速获得检测结果，既解决了传统病毒培养困难、培养周期较长等问题，也弥补传统免疫学手段阳性率低的缺点。

3.4.1 聚合酶链式反应（PCR）技术 PCR 检测具有高敏感性、高特异性、快速、经济等特点,已经成为了呼吸道病毒感染最常选择的检测方法。随着逆转录 PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）、多重 PCR （multiplex PCR，mPCR）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等技术的应用，可实现多种呼吸道病毒实时定量同步检测[24-26]。新冠肺炎疫情发生初期,也是最先建立RT-PCR完成核酸检测。其中建立多重PCR 方式以提高对多种呼吸道病毒核酸检测的高效性,多重呼吸道病原体基因检测(Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel，NxTAG-RPP)可在一个闭管中同时检测22 呼吸道病原体。在多重PCR 基础上，联合毛细电泳片段分析方法可完成对呼吸道病毒核酸的检测。目前成熟的多重PCR 检测呼吸道病毒感染的方法还包括mOTNRT-PCR、Panther Fusion respiratory assay、FTD21 kit、GeXP assay、Qiagen ResPlex II V2.0 kit、FilmArray multiplex PCR system[27-29]。

3.4.2 等温(恒温)扩增技术 等温扩增过程仅在恒定温度下完成扩增，在加快扩增速度的同时,也降低了对仪器设备的依赖性。目前主要包括环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滚环核酸扩增（rolling circleamolification,RCA）、核酸序列扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、解链酶扩增（Helicase-dependent amplification，HDA）、链置换扩增（Strand displacement amplification，SDA）等[30]。其中 LAMP技术主要通过环介导等温扩增的六个区域设计四条引物, 利用链置换型DNA 聚合酶在恒温条件下进行扩增反应,可在15~60min 内实现109~1010 倍的扩增,可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。目前此项技术已经在新冠病毒核酸检测中广泛开展。由于不需要实施温度梯度，可以实现随到随测的急诊模式，显著缩短传染病疫情门急诊疑似病人的病原学诊断的等待时间。

3.4.3 芯片检测 近年来芯片技术发展迅速，基因芯片、蛋白质组芯片等技术已经逐渐应用到临床诊断的许多领域。病毒基因检测芯片可根据病毒特征基因序列设计寡核苷酸探针,固定在基质上制成芯片, 从来源于患者的样品中提取病原体核酸,经扩增和荧光标记后和芯片杂交检测。将微流控芯片技术与核酸扩增技术结合,已经形成了商业化的病毒核酸检测芯片产品,可短时间内完成多种病毒基因检测，实现快速、广谱、高效的诊断需求[31]。

3.4.4 病毒基因测序 基因测序可通过对核酸序列的解码完成病毒的识别和鉴定[32]。目前一代测序技术已经广泛在临床开展及应用,通过Sanger 测序等方法获得特定病毒的基因片段，进而获取其序列信息，完成病毒鉴定，但也存在核酸信息数据量少、鉴定能力不足且成本高昂等缺点。

二代测序（next-generation sequencing，NGS）可同时检测多种病毒的保守基因序列,提供呼吸道标本中所有病毒的基因组信息及病毒组成,完成对呼吸道病毒高通量检测[33]。而宏基因组测序直接对呼吸道标本中的病毒核酸进行高通量测序,得到的序列信息与数据库进行比对,可识别包括已知和未知呼吸道病毒,在罕见病毒及新发呼吸道传染性病毒诊断方面具有显著优势[34]。但目前宏基因组测序花费昂贵,且存在宿主基因的干扰是限制其应用的主要问题。而此次新冠病毒早期发现也是得益于基因组测序技术的发展,提升了临床对新发传染性呼吸道病毒的早期预警能力。

3.4.5 其他快速检测技术 随着生物医学技术的发展,色谱技术、光谱技术、生物传感器及光电分析技术、计算机芯片技术在临床上的应用日益增加，联合免疫和分子生物学技术的引进,病毒检测呈现床旁化、自动化及简单化趋势。质谱技术具备快速、灵敏、特异及高通量等特点，目前已经广泛应用于细菌的鉴定之中, 而在病毒检测领域应用相对较少。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术可用于检测临床样本和分离培养样本中的病毒蛋白质组。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDITOF MS)技术也可用于检测呼吸道病毒及型别。

表3 不同呼吸道病毒诊断技术的优缺点[35]

综上所述，病毒培养、抗原抗体检测等传统的实验室病毒检测技术所存在的短板难以实现快速有效、敏感诊断呼吸道病毒感染的需求。分子诊断技术已逐步成为病毒实验室诊断的核心,可缩短诊断的窗口期，提升了病毒感染诊断的能力。以核酸扩增技术及基因测序技术为主导的新型分子诊断技术的应用,彻底改变了呼吸道病毒感染诊断的进程,在经历 2003 年 SARS、2009 年 H5N1，再到 2020年SARS-CoV-2 的洗礼,呼吸道病毒感染的分子诊断正逐步走向成熟。因此，在应对呼吸道病毒感染中，建立更快速、更灵敏的、更特异的病毒检测诊断体系，尤其是针对新发传染性呼吸道病原体，简单、快速的高通量定性或定量病毒检测，尤其是床旁或社区检测，会具有广阔的应用前景。