荷叶铁线蕨的无菌条件下诱导原叶体

望雄英

（长江珍稀植物研究所，湖北 宜昌 443100）

1 材料与方法

1.1 植物材料

实验采用的是成熟未开裂的荷叶铁线蕨孢子，采自植物所温室。

1.2 实验方法

（1）无菌播种。利用75%酒精对收集的成熟且未裂开的孢子表面进行消毒，每次30s，然后进行5min0.1%的升汞（HgCl2）的消毒，利用无菌水进行5～6 次冲洗，表面水分的吸取采用无菌滤纸。然后放置在无菌环境中，利用经消毒的无菌镊子将孢子夹起放置于培养基上方，立即将瓶盖盖好，并进行标记，置于培养箱中进行为5d 的暗培养，然后将其放置于培养室，调整培养温度大约为（25±2）℃，光照度设定为2000～2500lx，光照每日12h。

本次实验主要设计了培养基6 组，并以此为基础设置2 个不同pH 的实验组，pH 分别设置为5.8 与7.0，总计进行培养基实验的有6 组。

表1 孢子萌发培养基

（2）孢子诱导。无菌条件下，向不同孢子体诱导基质中转接孢子体，其直径为0.5cm，每种培养基配置数量为10 瓶。培养温度调整为大约（25±2）℃，光照调整为2000～2500lx，光照时间为每日16h。孢子体诱导基质是以无菌条件下，添加不同基质，其中基质设置了4 种配比，详情如表2 所示。从表2 可见，基质为泥炭；珍珠岩=6：1 时诱导率最高，原叶体具有良好的长势，且具有较高的诱导率，同其他不同基质培养的苗相比更加健壮，颜色呈鲜绿色。若河沙数量较多，则会降低原叶体诱导系数，苗径较小，而且颜色呈黄色。

2 结果

2.1 孢子无菌萌发

在培养基上放置孢子进行培养，20d 后，出现显著萌发现象，孢子吸收膨胀，从黄褐色向绿色转变，27d 后，可以发现孢子呈绿色小蘑菇状，即孢子体。

表2 基质对孢子诱导的影响

根据孢子萌发数量分析，培养基中，4 号和6 号孢子萌发率较其他培养基高，而且长势良好，萌芽发展速度快，也就是采用单一激素6-BA 而且质量浓度是1.0mg/L 的环境中，孢子萌发状况号，其中，6 号培养基中孢子萌发较4 号培养基更优，部分孢子体经过60d 的培养，仅有少部分的孢子会继续成长，但是并不能够分化出原叶体。尽管处于同一培养基中，但是往往存在不同发育阶段的孢子体。

2.2 孢子体诱导

向不同孢子体诱导培养基中转接直径为1cm 的孢子体，经20d 培养后，可以发现孢子出现诸多小突起，经38d 培养后，可以发现蘑菇状萌芽。

2.3 生根移栽

在无菌操作条件下，将诱导出的原叶体定期喷施无菌水和高温消毒的液态培养基，经70d 培养后发现原叶根基位置幼根较多，生根过程中，幼苗越长越高且变粗，同时叶片数量越来越多，颜色也发生改变，最终呈完整且健壮的植株。在原叶体生长至大约3cm 高度时，可向培养室外移炼苗，并逐步驯化，一直到可以进行野外栽培。

3 讨论

（1）荷叶铁线蕨孢子的无菌萌发。本实验中，各个培养基中的荷叶铁线蕨的孢子萌发率超过90%，仅有少部分孢子可能由于培养基失水导致其无法吸水进行造成，均可以萌发。本研究中，采用由温室中培养的荷叶铁线蕨的孢子，均已经发育成熟但是并没有裂开，可见有性生殖类型均正常，所有具有较高的萌发率。

无菌播种实验中，pH 培养基包括2 种，也就是5.8 与7.0，通常采用pH 为5.8 的植物组织培养基，因为pH 为7.0 的培养基对于植物的生长不利。但是经实验发现，荷叶铁线蕨在pH 为5.8与pH 为7.0 的培养基中培养，萌发状况无明显差异，与此同时，萌发后具有显著的孢子体生长状况，未来孢子体根诱导和体诱导期间，生长状况无明显差异。在pH 为7.0 时，培养基具有良好的硬度，且液化难度较大，可以很好的支撑苗，所以可以考虑应用于荷叶铁线蕨培养体系中，将pH 为7.0 应用其中。

经实验发现，处于质量浓度是1.0mg/L 和单一激素6-BA 培养基中的荷叶铁线蕨的孢子具有良好的萌发效果。

（2）不同生长调节剂对荷叶铁线蕨孢子增殖与生根诱导的影响。以前人的研究为依据，本实验主要采用了2 种植物激素，分别是NAA 和6-BA。结果显示，荷叶铁线蕨孢子体诱导影响因素有很多，其中以不同浓度的6-BA 为主，而NAA 无显著影响。在6-BA 质量浓度是1.0mg/L 时，具有较高的诱导率，在pH 为7.0时，培养基具有良好的硬度，不容易液化，可以很好的支撑苗。所以，荷叶铁线蕨孢子培养过程中，应加强对pH 为7.0 培养基培养的重视。相似诱导生根阶段，大部分采取NAA，以往实验中，主要通过NAA 对诱导生根并培养，但是不同于其他报道研究结果，本实验主要通过无菌基质诱导生根，生根效果不佳。其可能与蕨类植物自身发育特点存在紧密联系，此外，实验阶段温度程度也是主要影响因素，为获取显著移栽效果，需进一步进行研究。

（3）活性炭影响着荷叶铁线蕨组织培养。植物组织培养过程中，主要采取活性炭，添加活性炭可抑制或者加快离体生长速度。经实验发现，添加活性炭可加快孢子生长速度和萌发速度，所以原叶体诱导过程中，添加活性炭会对生根抑制，原因如下：由于活性炭将质基由荷叶铁线蕨生长代谢形成的有害物质吸出，对于孢子的萌发有利，而且可以加快孢子体生长速度，但是因为活性炭可以将部分营养物质吸出，所以生根培养过程中可利用高温方式灭菌基质，但是具有较低的营养物质浓度。生根的苗营养物质需求量多，但是因为活性炭将部分营养物质吸出，导致其无法保证植物所需营养物质，所以进一步抑制了生根。