慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响

孙志兵，杨 娟

糖尿病在中国已经成为影响居民生活质量的主要问题之一，在经济发展、生活条件富足以及人口老龄化等多种因素驱使下，糖尿病的发病人数仍在逐年上升[1-2]。糖尿病发病机制主要为胰岛素相对分泌不足及胰岛素抵抗，2型糖尿病是我国主要的糖尿病类型，胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中发挥重要作用[3-4]。当前对于介导胰岛素抵抗信号的转导通路有较多研究，其中有关细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)介导胰岛素抵抗信号转导通路的研究也有一定进展[5-6]，但目前较少有文献对SOCS3介导多条信号转导通路引起胰岛素抵抗进行报道。本研究通过构建2型糖尿病大鼠模型，探讨慢病毒介导沉默SOCS3基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。现作报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 雄性5周龄SD大鼠40只，购自北京维通达生物技术有限公司，大鼠许可证号：SCXK(京)20170011，体质量170～230 g，所有SD大鼠均饲养于SPF级动物房。实验动物操作程序符合《实验动物管理和使用指南》规定，本实验研究方案通过医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozocin，STZ)试剂购自美国Sigma公司；空慢病毒载体购自北京义翘神州科技有限公司；葡萄糖测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海一基实业有限公司；血脂生化检测试剂盒购自上海透景诊断科技有限公司；Trizol RNAiso购自日本Takara公司；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒购自北京九州天瑞科技有限公司；总RNA提取试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司；反转录试剂盒均购自美国Applied Biosystems公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京金克隆生物技术有限公司；兔抗鼠SOCS3蛋白、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1，IRS1)、磷酸化IRS1(pIRS1)、胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate-2，IRS2)、磷酸化IRS2(pIRS2)、信号传导及转录激活因子-5b(signal transducers and activators of transcription-5b，STAT5b)、磷酸化STAT5b(pSTAT5b)一抗购自美国Novus Biologicals公司；兔抗鼠酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)、磷酸化JAK2(pJAK2)、信号转导及转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)、磷酸化STAT3(pSTAT3)一抗均购自美国Abcam公司；羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruz公司。KETA S凝胶成像分析系统购自美国Wealtec Corp公司；PCR仪购自美国Bio-rad公司，CFX96型；全自动生化分析系统购自美国Beckman Coulter公司，AU5800型。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒介导沉默SOCS3基因构建 慢病毒SOCS3 RNAi构建由北京义翘神州科技有限公司完成，载体构建完成后由该公司提供基因测序结果，由我实验室人员进行确认。

1.2.2 大鼠糖尿病模型构建及分组 大鼠糖尿病模型构建：40只大鼠给予高糖高脂饲料(配比：胆固醇5%、猪油脂10%、蔗糖10%、普通饲料65%)喂养，饲养4周后，大鼠腹腔注射STZ缓冲液(STZ溶液1%，柠檬酸缓冲液99%)30 mg/kg。注射5 d后，随机3次测量鼠尾血糖，血糖值>16.7 mmol/L为大鼠2型糖尿病模型构建成功。建模成功大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、空白载体组和观察组，各10只。分组后1、15 d，观察组大鼠尾部注射SOCS3 RNAi慢病毒载体，每次1.5 mL；空白载体组大鼠尾部注射空慢病毒载体，每次1.5 mL；空白对照组不进行处理。继续饲养4周，所有大鼠禁食，收集血清、肝脏组织标本，肝脏组织标本于-80 ℃保存待检。

1.2.3 大鼠血糖、血脂和胰岛素水平检测 载体注射4周后，检测大鼠空腹血糖、胰岛素、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TC)水平。其中空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法检测，胰岛素测定采用ELISA法，HDL-C、TG、LDL-C和TC采用全自动生化分析仪测定。

1.2.4 RT-PCR检测大鼠肝脏组织相关mRNA表达 取大鼠肝脏组织1 g，以研磨棒充分研磨，加入1 mL Trizol RNAiso，提取总RNA，反转录操作参照反转录试剂盒说明书，提取20 μg RNA反转录为cDNA，GAPDH、SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2、STAT3引物由北京义翘神州科技有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，循环完成后在72 ℃条件下继续延伸10 min。采用FS2000系统进行分析，并采用2-△△CT法计算mRNA相对表达量。

表1 各目的基因引物序列

1.2.5 Western blotting法检测大鼠肝脏组织相关蛋白表达 取大鼠肝脏组织1 g，以研磨棒充分研磨，加入1 mL RIPA细胞裂解液，各组细胞在冰上裂解30 min，移入1.5 mL离心管中，在预冷的4 ℃离心机中5 000 r/min离心5 min后提取上清，95 ℃煮沸后，收集蛋白备用。提取40 μg总蛋白，在120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，采用电转移法转移至聚偏氟乙烯膜上，室温下用50 g/L脱脂奶粉进行封闭2 h。随后加入稀释的兔抗鼠SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3一抗(1∶1 000)，在4 ℃条件下进行孵育过夜备用。第2天用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释液洗涤孵育后的溶液3次，然后加入山羊抗兔稀释二抗(1∶1 000)孵育2 h，用PBST稀释液洗涤3次，然后用二氨基联苯胺(DAB)显影液处理样本。采用Image J软件分析蛋白条带。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 3组大鼠体质量比较 3组大鼠均精神状态较好，毛发光滑。3组大鼠入组时和注入载体后4周体质量差异均无统计学意义(P>0.05)；构建糖尿病模型后，空白载体组和观察组大鼠体质量均明显高于空白对照组(P<0.01)，空白载体组和观察组差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 3组大鼠不同时点体质量比较

q检验：与空白对照组比较**P<0.01

2.2 3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较 观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、TG、LDL-C和TC水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01)，HDL-C水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01)；空白对照组和空白载体组大鼠上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3 3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较

q检验：与空白对照组比较**P<0.01；与空白载体组比较△△P<0.01

2.3 3组大鼠相关mRNA表达水平比较 除STAT3 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)外，3组大鼠SOCS3 mRNA、STAT5b mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中，观察组大鼠SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01)，IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05～P<0.01)；空白对照组和空白载体组相关mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 3组大鼠相关mRNA表达比较

q检验：与空白对照组比较**P<0.01；与空白载体组比较△P<0.05，△△P<0.01

2.4 3组大鼠相关通路蛋白表达比较 除STAT3蛋白表达间差异无统计学意义(P>0.05)外，3组大鼠相关通路蛋白表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中，观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b蛋白表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01)，IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01)；空白对照组和空白载体组各通路蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表5)。

表5 3组大鼠胰岛素通路蛋白表达的比较

分组npSTAT5bJAK2pJAK2STAT3pSTAT3 空白对照组101.02±0.202.00±0.210.88±0.091.90±0.201.00±0.12 空白载体组101.03±0.182.01±0.230.87±0.101.89±0.231.01±0.11观察组100.73±0.12∗∗△△2.32±0.19∗∗△△1.23±0.09∗∗△△1.96±0.171.29±0.18∗∗△△F—10.037.4648.130.3513.80 P—<0.01<0.01<0.01>0.05<0.01 MS组内—0.0290.0440.0090.0410.020

q检验：与空白对照组比较**P<0.01；与空白载体组比较△△P<0.01

3 讨论

SOCS3基因参与了多个细胞因子的信号转导通路，目前认为其主要通过JAK-STAT信号通路对相关因子发挥作用。有研究[7-8]显示，其在糖尿病发生、发展过程中发挥一定作用。有研究[9]通过不同小鼠模型诱导SOCS3基因失活，对瘦素敏感性及胰岛素抵抗进行观察，发现失活SOCS3基因对瘦素的表达有一定影响，并通过瘦素信号转导介导血糖变化，同时降低了胰岛素抵抗作用。WANG等[10]对糖尿病小鼠进行FGF-21基因敲除，对血糖、胰岛素、STAT3-SOCS3通路蛋白进行检测，结果显示，小鼠糖原异生、糖原分解增加，而后血糖水平升高，同时降低了STAT3-SOCS3通路磷酸化水平，导致胰岛素抵抗增加，也进一步印证了STAT3-SOCS3通路的激活与胰岛素抵抗有一定相关性。本研究沉默SOCS3基因表达后，对STAT5b介导信号通路蛋白表达及血清指标变化进行检测，以探讨SOCS3介导胰岛素抵抗的信号通路情况。

本研究以STZ诱导大鼠糖尿病模型，共30只大鼠构建成功，在注射载体4周后，大鼠体质量差异未见统计学意义。研究[11]显示，在糖尿病大鼠饲料中添加苦瓜提取物，能够有效降低大鼠体质量，同时大鼠肝脏中SOCS3及JNK基因表达具有明显差异，说明苦瓜提取物影响大鼠体质量过程中，SOCS3可能参与了胰岛素抵抗的过程，进而影响体质量变化。这与本研究结论不一致，原因可能包括选取的试剂不一致、研究目的不同，可能还存在其他通路影响大鼠的胰岛素抵抗水平，因此得到结论存在差异。在血清指标方面，观察组大鼠血糖、胰岛素水平均低于其他2组，分析其原因可能为沉默SOCS3基因表达后，能够降低胰岛素抵抗，从而降低血糖。ZHOU等[12]对幽门螺杆菌感染诱导肝脏胰岛素抵抗信号通路进行研究，结果显示，SOCS3在幽门螺杆菌介导胰岛素抵抗中发挥了一定作用，支持本研究结果。同时，我们也发现观察组血脂指标变化也优于其他2组，我们推测SOCS3基因表达与血脂指标具有一定相关性，拟在以后的研究中进行进一步探索。

本研究对SOCS3基因和蛋白表达进行检测，结果显示，观察组表达水平低于其他2组，提示慢病毒介导沉默SOCS3基因载体注入后，达到了预期目的，为后续实验做好了准备；而空白对照组和空白载体组在基因表达方面未见差异，排除慢病毒载体的干扰。结合上述空腹血糖和胰岛素表达，进一步证实SOCS3在胰岛素抵抗病理机制中发挥了作用，与相关研究[13-15]结论一致。此外，观察组STAT5b mRNA低于其他2组，IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA高于其他2组，而3组STAT3 mRNA无明显差异，提示下调SOCS3基因表达可抑制STAT5b mRNA，增加IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA的表达，对STAT3 mRNA的表达影响不大。

本研究结果显示，在信号通路蛋白表达及磷酸化方面，沉默SOCS3基因后，抑制了STAT5b蛋白及其磷酸化，上调了IRS1、IRS2蛋白表达及磷酸化。推测可能为SOCS3基因通过调节STAT5b的表达及磷酸化介导IRS1、IRS2的表达，进而介导胰岛素抵抗。有研究[16]显示，上调SOCS3表达可下调IRS1表达，同时增加IRS1磷酸化，进而介导胰岛素抵抗，与本次研究结论存在差异，还需进一步研究探讨。我们在研究中还发现，下调SOCS3基因后，JAK2的表达水平及磷酸化增加，STAT3磷酸化增加，但STAT3蛋白表达未见明显增加，分析可能为SOCS3不仅介导了JAK2/STAT3通路，过程中可能STAT3蛋白也介导了其他通路的信号转导。MAHONY等[17-18]提出，SOCS3是多种细胞因子信号转导的基础，SOCS3高表达通过调控JAK/STAT信号通路介导糖尿病发生。BLUYSSEN等[19]研究指出，SOCS3基因与 JAK2/STAT3通路互相形成一个反馈回路，糖尿病病人出现胰岛素抵抗时，伴随着多种细胞因子增加，激活JAK2/STAT3通路，诱导SOCS3表达增加，同时SOCS3又能够负反馈调节JAK2/STAT3通路，从而进一步诱导胰岛素抵抗。这与本研究结果存在差异。而张旭等[20]研究显示，SOCS3通过负性调节STAT3活化，介导胰岛素抵抗，支持本次研究结论。可认为目前该通路介导胰岛素抵抗的机制尚不十分准确，还需进一步实验研究证实。

综上，SOCS3可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗，沉默SOCS3基因，可介导相关信号通路抑制胰岛素抵抗，进而改善糖尿病症状。