李 娴,邢亚东,李姗姗,刘 浩
地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》,列为上品,现代被誉为“四大怀药”之一。生地黄经不同炮制方法,加工成熟地黄后,其药性由寒转温,味由苦转甘,功效由清转补,具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。熟地黄临床应用广泛,属于高配方频度中药之一。然而因其味甘而腻,易于助湿生满,有碍脾胃消化吸收,病人服用后,会出现滋腻碍胃的现象,即胃纳欠佳、腹胀、便溏等反应[2]。明代李时珍在《本草纲目》首次记载用酒和砂仁炮制地黄,指出因熟地黄质厚味浓,滋腻碍脾,酒制后其性转温,主补阴血,并可借酒力行散,起到行药势、通血脉的作用,同时借助砂仁香窜之性,合和五脏冲合之气,归宿丹田。
目前熟地黄常用的炮制方法有2015版《中国药典》中收录的清蒸法和酒炖法,这两种炮制方法中均未加入辛香类药物。2005版《河南省中药饮片炮制规范》中收录的九蒸九晒法,加入了砂仁。因此,本实验分别选用清蒸法、酒炖法和九蒸九晒法3种方法炮制的熟地黄为供试品,通过建立HPLC法同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分含量,考察不同炮制方法对熟地黄主要化学成分的影响,以期为熟地黄临床应用和综合开发利用提供实验依据。
1.1 仪器 赛默飞UltiMate3000型高相液相色谱仪(美国赛默飞科技公司,配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器),赛默飞色谱工作站(美国赛默飞科技公司);KQ-600KDE1超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司;XS105分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2 试剂与样品 梓醇(中国食品药品检定研究院,批号:110808-201711,纯度99.6%),益母草苷(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:YA220607,纯度≥98%),地黄苷A(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:DR192237,纯度≥98%),地黄苷D(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:DR210025,纯度≥98%),毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院,批号:111530-201713,纯度92.5%),异毛蕊花糖苷(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:YI3306019,纯度≥98%),5-HMF(中国食品药品检定研究院,批号:111626-201711,纯度99.4%),甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地有限公司),磷酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司),水为娃哈哈纯净水。
黄酒(中国绍兴黄酒集团有限公司,生产批号:20170627,酒精度15%);地黄Rehmanniae Radix(产地河南)、砂仁Amomi Fructus(产地广东),均购自蚌埠医学院第二附属医院,经蚌埠医学院王迪生副教授鉴定,符合《中国药典》2015年版要求[5]。
1.3 HPLC色谱条件 色谱柱:赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,程序为:0~8 min,1%B;8~9 min,1%~4%B;9~25 min,4%B;25~35 min,4%~20%B;35~50 min,20%B;50~50.01 min,20%~1%B;50.01~55 min,1%B。柱温:30 ℃;检测波长:203 nm、332 nm,波长切换:0.00~29.00 min,波长203 nm,29.01~55.00 min,332 nm;进样量:1 μL。
1.4 供试品的制备
1.4.1 清蒸熟地黄的制备 取生地黄,蒸制12 h,闷12 h后,上下翻动1次,如此反复蒸闷2次,70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出,放凉即得[3]。
1.4.2 酒炖熟地黄的制备 取生地黄,加入黄酒拌匀,每100 kg生地黄用黄酒40 kg[3],闷润至酒吸尽,连续炖制48 h后(炖制24 h时,上下翻动1次),70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出,放凉即得。
1.4.3 九蒸九晒熟地黄的制备 取生地黄,加黄酒适量拌匀一段时间后闷润至酒吸尽,以武火加热,用容器收集流出的熟地黄汁,蒸约48 h至地黄中央发虚为度,取出,晒1 d;再拌入熟地黄汁和黄酒,再蒸24 h,取出再晒1 d;如此反复,蒸晒8次。至第9次,将黄酒与砂仁粉一起拌入,蒸24 h,以蒸至内外漆黑,味甜酸无苦味为度,取出即得。每100 kg生地黄用黄酒50 kg、砂仁粉0.9 kg[4]。
1.5 对照品储备液的制备 分别取梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF对照品适量,精密称定,加入甲醇溶解制成质量浓度分别为2.189 2、2.165 8、2.035 0、3.557 4、2.244 2、2.016 8、2.062 6 mg/mL的混合对照品储备液。
1.6 供试品溶液的制备 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄经粉碎(过4号筛)所得的粉末约2.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入甲醇50 mL,精密称重,30 ℃水温超声处理40 min,过滤,放冷,补重,精密量取滤液25 mL,水浴蒸干,残渣加10%乙腈溶解,转移至10 mL量瓶中并定容,备用。
1.7 系统适用性 分别取混合对照品溶液和供试品溶液,按“1.3 HPLC色谱条件”进样分析,各色谱峰的拖尾因子均在0.95~1.05之间,与相邻色谱峰的分离度大于1.5,梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的理论塔板数均大于6 800。
2.1 HPLC定量方法学考察
2.1.1 专属性 通过比较空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图考察专属性。结果表明,供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰,分析方法专属性良好,色谱图见图1~3。
2.1.2 检测限与定量限 取各对照品溶液适量,加入甲醇溶液逐步稀释,以信噪比3时对应待测物浓度为检测限,以信噪比10时对应待测物浓度为定量限进行测定,结果见表1。
表1 各对照品的检出限和定量限
2.1.3 线性与范围 分别精密量取梓醇、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、5-HMF对照品储备液适量置5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制得浓度分别为271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合对照品工作液。按高效液相色谱条件分别精密吸取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL,依法测定,记录色谱峰的峰面积,以各对照品浓度X(μg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归计算,结果见表2。
表2 各成分线性关系
2.1.4 精密度 精密吸取对照品溶液,在色谱条件下进样6次,每次5 μL,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46,表明仪器精密度良好。
2.1.5 稳定性 精密吸取同一供试品溶液,在色谱条件下分别于0、1、3、5、12、24 h测定,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45,表明溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.6 重复性 取清蒸熟地黄,按1.6方法平行制备供试品溶液6份,在色谱条件下,测得毛梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42,表明该方法重复性良好。
2.1.7 加样回收率 精密称取清蒸熟地黄粉末9份,每份1 g,精密秤定,精密加入对照品适量。按“1.6”项下方法制备供试品溶液,在色谱条件下,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF平均加样回收率RSD分别为1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。
2.2 样品含量测定 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄各约2 g,精密称定,按“供试品溶液的制备”项下操作,制备供试品溶液,按“高效液相色谱条件”进样5 μL,测定峰面积,采用外标法对梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的含量进行测定,结果见表3。
表3 样品测定结果(n=3)
本实验首次建立了同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF含量的HPLC方法。测定了熟地黄3种不同炮制品,即清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄中以梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D为主的环烯醚萜苷类成分,以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主的苯丙素苷类成分,以及5-HMF的含量。实验预试中,经查阅文献,5-HMF的提取方法主要有水浴回流提取和超声提取两种方法[5]。考虑到回流提取的加热过程中,可能会使熟地黄中的多糖自身发生水解、脱水反应生成5-HMF,导致5-HMF含量偏高,实验数据不准确。故本实验采用超声提取方法,制备供试品溶液。
本实验结果显示,生地黄中不含5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中,环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解;环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低;可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解;可以检测到5-HMF。
通过实验数据分析可知,由于梓醇和益母草苷都是环烯醚萜单糖苷,热稳定较差,地黄经过清蒸、酒炖和九蒸九晒加热过程后,其含量降低至几乎全部降解。地黄苷A和地黄苷D是环烯醚萜双糖苷,毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于苯丙素苷,均相对稳定,在清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中均可以检测到,但较生地黄含量下降。可能因为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为咖啡酸酯,在炮制过程中发生酯键的断裂,从而生成咖啡酸[6]。而九蒸九晒熟地黄蒸晒次数较多,上述成分几乎全部降解。地黄在清蒸、酒炖和九蒸九晒过程中发生了Maillard 反应,生成了5-HMF。5-HMF在含糖中药的炮制过程中都有可能生成,与炮制时间和温度密切相关,现已成为中药炮制原理研究的活性成分,具有抗心肌缺血、抗氧化、降血糖、改变血液流变性和神经保护性作用[5]。
综上,通过测定熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量,可知不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大,尤其是九蒸九晒熟地黄在反复蒸晒过程中苷类逐渐降解,其生成何种化合物,与九蒸九晒熟地黄增效袪腻药效变化是否有关,值得进一步深入研究。