ε-聚赖氨酸的生物合成及其在医药领域的应用

王爱霞 王秀文 秦加阳 谢则平,2 于 波

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 山东国际生物科技园发展有限公司；3 中国科学院微生物研究所 北京 100080

ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine，ε-PL)是由L-赖氨酸的α-氨基和ε-羧基通过酰胺键连接而成的聚合物(图1)，最早在1977年由日本学者Shima和Sakai在白色链霉菌发酵液中分离纯化得到[1-2]。ε-PL是白色或淡黄色粉末，略有苦味，不稳定，吸湿性强，极易溶于水，难溶于有机溶剂，因此多数以氢溴酸盐的形式存在[3]。ε-PL通常是不同聚合度分子组成的混合物，一般由25～35个L-赖氨酸残基聚合而成，因此没有固定的熔点，当温度达到250℃以上开始软化分解[3]。ε-PL具有抑菌谱广、杀菌能力强、安全无毒、水溶性和热稳定性好、耐高温且在酸和碱性环境中比较稳定，同时具有生物可降解性和可食用性等优良特性，因此，ε-PL已被美国、日本、韩国和中国等国批准作为食品防腐剂[2-3]。此外，ε-PL还可以用作基因载体、减肥保健品、药物载体、新型吸水材料、芯片及生物电子包被剂等[2-3]。

目前，ε-PL的主要生产方法是生物合成法，多采用微生物发酵法，本文将主要针对近五年来国内外在ε-PL生物合成方面的研究进行综述，着重探讨ε-PL生产菌株的新型育种方法以及ε-PL在医药领域的应用新进展，并对ε-PL研究的发展趋势进行展望。

1 ε-PL生产菌的筛选以及发酵策略

迄今最为经典的ε-PL生产菌株的筛选方法是2002年日本学者Nishikawa和Ogawa发明的利用酸性染料Poly R-478的方法，该染料可与带正电的ε-PL发生静电相互作用从而使菌落周围出现明显的浓缩圈[4]。此后，亚甲基蓝[5]、甲基橙[6]等染料相继用于ε-PL生产菌株的筛选。近年来筛选得到的ε-PL生产菌株有小白链霉菌Streptomycesalbulus[7]、淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes[8]、金霉素链霉菌Kitasatosporaaureofaciens[9]、地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis[10]和蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus[11-12]等。

为了提高ε-PL的产量，各种培养基优化方法和发酵控制策略相继得到利用。Ren等[13]利用Streptomycessp. M-Z18采用分阶段pH控制的方法发酵生产ε-PL，发酵前期控制pH为5，使菌丝快速生长，然后将pH降至3维持12 h提高菌丝代谢活性，最后将pH控制在4从而有利于ε-PL的积累，最终ε-PL的产量达到54.7 g/L。此后，Ren等[14]又采用向培养基中添加滑石粉微粒的方法进一步将ε-PL的产量提高到62.36 g/L。Xu等[15]在发酵培养基中添加0.5%的正十二烷，控制发酵过程中溶解氧浓度在32%以上，最终ε-PL的产量达到30.8 g/L。Pan等[16]利用pH休克策略提高小白链霉菌以葡萄糖为底物时ε-PL的产量，最终的产量和体积生产效率分别达到32.22 g/L和5.86 g/L/d，比常规发酵提高32.3%和36.6%。Bhattacharya等[10]利用中心网络模型方法优化培养基，使地衣芽孢杆菌发酵生产ε-PL的产量提高了196.7%。Guo等[8]以淀粉酶产色链霉菌 6#-7作为研究对象，利用响应面法优化了培养基中葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的浓度，使ε-PL的产量达到25.5 g/L，比初始产量提高了56.4%。Yan等[17]在发酵培养基中添加谷胱甘肽(GSH)，降低菌体内活性氧(ROS)水平，使ε-PL最高产量达到46.5 g/L。

2 ε-PL合成酶和降解酶的研究进展

2.1 ε-PL合成酶(Pls) 1983年，Shima等[18]利用同位素技术证明了L-赖氨酸是ε-PL合成的前体；此后，直到2003年，Kawai等[19]利用无细胞体系实现了ε-PL的合成，他们发现合成活性在细胞膜上，该酶活性依赖于ATP且不受核糖核激酶、卡那霉素、氯霉素影响，这些研究结果说明ε-PL合成是一个膜蛋白催化的反应。2008年，Yamanaka等[20]从小白链霉菌S.albulusNBRC14147中纯化了ε-PL合成酶，发现该酶分子量为130 kDa，是一个不寻常的非核糖体肽合成酶，具有腺苷酸化和硫醇化结构域，没有传统肽合成酶的缩合或硫酯酶结构域，有六个跨膜结构域围绕三个串联可溶结构域，这些串联结构域使用游离L-赖氨酸聚合物(或初始反应中的单体)作为受体和Pls结合的L-赖氨酸作为供体不断催化L-赖氨酸聚合，直接产生不同长度的链。随后，Geng等[21]在变铅青链霉菌S.lividans中异源表达了来自S.albulus的Pls并实现了ε-PL的生产，进一步证明了Pls在ε-PL合成中的功能。Hamano等[22]发现ε-PL肽链的长度受到Pls跨膜区连接DNA序列的影响。

Wang等[23]研究ε-PL生物合成过程中发现一个对pH变化非常敏感的σ因子(HrdD)，并利用凝胶迁移实验证明HrdD能够与Pls的启动子序列结合，因而很可能参与调控Pls的表达。Xu等[9]报道了一株含有特殊Pls的金霉素链霉菌，其生产的ε-PL分子量仅为1.3～2.3 kDa，明显小于25～35个赖氨酸聚合所得ε-PL的分子量(3.2～4.5 kDa)，他们发现低分子量的ε-PL对酵母菌的抑菌效果更好，在小白链霉菌中异源表达该Pls后，低分子量ε-PL的发酵产量达到了23.6 g/L。

2.2 ε-PL降解酶(Pld) 除了Pls外，另外一个和ε-PL生物合成直接相关的酶是ε-PL降解酶。在产生和耐受ε-PL的微生物中均检测到了Pld活性，因此，Pld在ε-PL降解和ε-PL生产者的自我保护中起着重要作用。2002年，Kito等[24]从ε-PL生产菌株S.albulus中纯化得到了Pld，研究发现该蛋白是个膜蛋白，其降解ε-PL模式是外切型，即从ε-PL的N-端开始一个一个的切下赖氨酸。2006年，Hamano等[25]从S.albulus中分离纯化得到Pld并对其进行分子克隆与功能分析，并构建了ε-PL降解酶失活敲除菌株，研究突变菌株降解酶活性、ε-PL敏感性以及产率，发现ε-PL降解酶基因失活对菌株影响较小，且认为该段基因编码的ε-PL降解酶在避免ε-PL毒性效应中起到一定作用。同时，菌株也存在其它ε-PL降解酶。2010年，Yamanaka等[26]在S.albulusNBRC14147中发现了第二个ε-PL降解酶PldII，敲除该酶的编码基因后突变株对ε-PL的降解活性大幅降低，说明PldII是主要的ε-PL降解酶。同时发现，降解活性的降低不会影响所产生的ε-PL的链的长度，说明ε-PL的聚合度是由Pls决定的。他们还发现，Pls的催化功能是受胞内ATP的水平调控的，高浓度的ATP是Pls完整酶活性所必需的，酸性pH环境并非能抑制Pld活性，而是胞内积累ATP所必需的。

3 新型育种方法在ε-PL生产中的应用

近年来，以核糖体工程、基因组重排、代谢工程为代表的新型育种方法逐渐应用于ε-PL生产菌株的改造。

3.1 核糖体工程 核糖体工程是利用各类抗性突变为筛选标记，高效获得次生代谢产物合成能力提高突变株的微生物定向育种新方法[27]。Wang等[28]通过等离子诱变技术和链霉素抗性筛选技术进行育种筛选，获得一株小白链霉菌突变菌株AS3-14，ε-PL的发酵产量达到41.2 g/L，比出发菌株提高了68.1%。吴光耀等[29]利用核糖体工程方法选育了小白链霉菌链霉素和利福平双重抗性突变株，在摇瓶和发酵罐发酵ε-PL产量的分别达到3.7 g/L和53.0 g/L，较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。Wang等[30]利用物理和化学方法进行诱变，选育了庆大霉素和利福平双重抗性突变菌株albulusSG-31，ε-PL的产量和体积生产效率分别达到了59.5 g/L/d和8.21 g/L/d，比出发菌株产量提高138%和105%。赖永勤等[31]选育Streptomycessp. XAY6作为出发菌株，通过利用常压室温等离子体(ARTP)诱变育种和核糖体工程技术，发酵产量达到2.096 g/L，比原始菌株提高118.6%。

3.2 基因组重排 基因组重排是在传统诱变育种技术的基础上，通过多亲本之间的DNA重组和全基因组片段交换，从而获得优良性状菌株的方法[32]。Li等[33]采用基因组重排和原生质体融合技术，得到一株突变株Streptomycessp. FEEL-1，其发酵产量达24.5 g/L，比野生菌株提高81%。Zhou等[34]利用基因组重排技术对ε-PL耐受菌进行筛选，获得了一株突变重组菌株Streptomycessp. F4-22，其产量达到39.96 g/L，比野生菌株提高32.7%。Wang等[35]通过基因组重排和庆大霉素抗性技术进行菌株选育，获得一株突变菌株S.albulusAG3-28，其ε-PL发酵产量达到56.5 g/L，比出发菌株提高50%。赵俊杰等[36]利用抗性筛选和基因组重排技术将小白链霉菌在摇瓶中的产量提高了70.63%。

3.3 代谢工程 代谢工程是利用基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，从而使目标代谢产物产量最大化的一类方法[37]。Pls是ε-PL合成途径中的关键酶，过量表达Pls有望提高ε-PL的产量，然而多次尝试利用组成型启动子过量表达Pls的研究均告失败[9,21,38]。本实验室利用小白链霉菌组成型启动子和核糖体结合位点实现了Pls基因的过量表达，同野生菌株相比，过表达菌株发酵生产ε-PL的产量提高了200%以上[39]。

赖氨酸是ε-PL合成的原料，提高胞内赖氨酸的浓度是提高ε-PL产量的又一策略。赖氨酸在细胞内合成的途径是天冬氨酸途径，这一途径中有两个关键酶：天冬氨酸激酶(Ask)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd)。其中，Ask负责将L-天冬氨酸磷酸化为L-4-磷酸天冬氨酸，Hamano等[40]发现S.albulus的Ask受到部分反馈抑制调节，于是他们构建了完全不受反馈抑制调节的突变蛋白rAsk(M68V)，在S.albulusCR1中表达了突变蛋白rAsk，结果ε-PL的产量由11 g/L提高到15 g/L。

溶氧是影响ε-PL代谢途径的关键因素之一，Xu等[41]将透明颤血红蛋白基因(VHb)整合到S.albulusPD-1染色体上，减轻发酵过程中氧气的限制，最终ε-PL发酵产量从22.7 g/L提升到34.2 g/L。Gu等[42]将透明颤血红蛋白基因和腺苷蛋氨酸合成酶基因插入到S.albulusNK660染色体上表达，ε-PL的产量提高了26.67%，生物量提高了14.57%。

氮源是限制ε-PL合成的另一个关键因素，每分子赖氨酸含有两个氮原子，因此，胞内赖氨酸的合成需要氮源较大，为了解决这个问题，Xu等[43]在S.albulusPD-1中过量表达了其自身的铵转运蛋白基因amtB，发酵培养基的最优碳氮比由3提高到了4.71，ε-PL的产量则由22.7 g/L提升到35.7 g/L。

4 ε-PL在医药领域的应用

ε-PL在医药领域的应用主要包括：新型抑菌材料、药物载体和核酸载体等。

4.1 新型抑菌材料 由于ε-PL具有良好的抑菌能力、食品安全性和生物可降解性，含有ε-PL的新型抑菌材料得到广泛开发。在再生医学材料领域，窦源东等[44]发明了一种抗菌性阳离子ε-PL改性的可吸收硬脑脊膜修复材料，该修复材料具有优异的抑菌特性，可有效预防术后颅内感染，同时既可直接贴附又可缝合使用。在生物医用材料领域，林前锋等[45]制备了一种聚赖氨酸复合水凝胶，该水凝胶通过灯盏花素、聚赖氨酸和氮掺杂石墨烯的有效结合，可加速创面伤口的愈合，具有止血、抑菌和从根源上抑制瘢痕形成的特点；徐虹等[46]制备了一种ε-PL-对羟基苯丙酸抗菌水凝胶敷料，该水凝胶敷料抑菌效果好，能有效防止伤口感染，且具有优良的生物相容性和生物可降解性。此外，ε-PL还被用来制作仿生抑菌膜[47]、口腔溃疡贴膜[48]、复合抗菌涂层[49]等。

4.2 药物载体 临床上抗肿瘤化疗药物如紫杉醇、长春新碱、阿霉素及喜树碱等存在着水溶性差、毒副作用大及无靶向性等问题。ε-PL水溶性高、生物相容性好、体内可被降解等特点使其在药物载体领域有着良好的应用前景。申有青等[50]利用ε-PL制备了一种两亲性聚乙二醇—ε-PL/异硫氰酸酯键合物纳米胶束，该纳米胶束载药率高、粒径小、体内稳定、系统毒性小且循环时间长，可作为安全高效的疏水性药物的递送载体。张静等[51]发明了一种具有电荷翻转及靶向功能的ε-PL纳米前药胶束，该纳米胶束以疏水性药物为内核，β-羧基酰胺化的ε-PL链为壳层，兼具主动、被动靶向等特点以及pH响应性能，在肿瘤靶向药物的制备中有着良好的应用潜力。苏文全等[52]发明了一种具有免疫调节作用的双链聚核苷酸—ε-PL—硫酸聚糖复合物，该类复合物与抗原物组成的免疫原组合物可用于预防、治疗微生物感染、抗肿瘤等用途。此外，在药物载体制备方面，以ε-PL为原料，张鲁中等[53]制备了一种载有治疗因子或神经营养因子的纳米微球，白钢等[54]发明了一种多用途ε-PL荧光自组装载药纳米微球。

4.3 核酸载体 缺乏高效安全的载体是目前临床基因治疗面临的最大挑战之一，非病毒载体—阳离子聚合物是其中很有希望的一类载体。袁晓燕等[55]制备了一种包括葡聚糖、ε-PL和靶向平滑肌细胞的多肽VAPG的核酸载体，可以保护核酸药物靶向进入平滑肌细胞，转染效率高达63.2%，降低了对其他细胞的生物毒性，在生物医用基因治疗领域有巨大的应用前景。杨波等[56]发明了一种水溶性和稳定性极佳、没有毒副作用的新型ε-PL—聚乙烯亚胺-β-环糊精聚合物，其中β-环糊精的空腔可以包裹水溶性差的药物以增加其水溶性，聚乙烯亚胺可与外源DNA凝聚形成纳米粒，该新型聚合物在药物载体和基因载体领域都有很高的应用潜能。此外，以ε-PL为原料，程义云等[57]发明了一种脂环化合物修饰的高分子材料，戴箭等[58]制备了一种改性阳离子聚氨基酸，两者均可用作核酸载体。

5 前景展望和未来研究重点

近五年来，国内ε-PL生产菌株的选育和发酵工艺研究取得了较大的突破，ε-PL的产量和体积生产效率已达到或超过世界先进水平，但除少数研究外[59]，多数停留在菌株选育和工艺优化阶段，对菌株高产机制的探索不够深入。因此，非常有必要利用比较基因组、比较转录组等方法解析菌株高产的机制，为利用基因工程、代谢工程等方法进一步提高菌株的生产能力提供理论支持。

L-赖氨酸是ε-PL合成的前体，ε-PL合成酶是将L-赖氨酸转化为ε-PL的关键酶，因此，如何提高胞内L-赖氨酸的浓度、增强ε-PL合成酶的活力是下一步高产菌株构建的重点研究方向之一。提高胞内L-赖氨酸浓度的方法包括增强L-赖氨酸的合成、减少L-赖氨酸的降解、增加L-赖氨酸从胞外向胞内的转运、减少L-赖氨酸的外排等[60]。增强ε-PL合成酶活力的方法有基因的过量表达和酶的定向进化，Bai等[61]测试了链霉菌中200余种启动子和200余种核糖体结合位点的强度，不同的排列组合有望得到更高的ε-PL合成酶基因表达强度。

虽然国内浙江新银象、江苏一鸣等生物技术公司相继建立了ε-PL的工业生产线，但仍存在产品用途开发不足、产品同质化等问题。目前，ε-PL的主要用途虽然是食品防腐剂，但其在新型抑菌材料、药物载体和核酸载体等领域展现出良好的应用潜能，医药领域极有可能成为未来ε-PL应用研究的主要增长点。