脱细胞基质面神经修复材料的制备

张雅群 张乃丽 赵冬梅 刘洪付

滨州医学院基础医学院解剖学教研室 山东 烟台 264003

在面部严重外伤、颞骨骨折及腮腺肿瘤手术时，面神经容易受到损伤，某些面部功能丧失。面神经损伤等周围神经缺损的修复是神经创伤临床研究的难点，关于神经替代物和神经修复方面的研究有很多，目前研究的神经替代物主要有人工合成材料、自体神经脱细胞神经支架等[1]。由于无免疫排斥、再生率高等优点，自体神经移植被作为周围神经损伤治疗的“金标准”[2]。但自体神经的来源非常有限，对于较大面积神经缺损或损伤存在严重的供应不足问题，还会造成部分供区的神经功能障碍。脱细胞处理的同种异体神经，即脱细胞神经基质(acellular nerve graft, ANG)作为移植物在促进神经再生方面已取得了较好的效果。本研究拟采用化学萃取法制备ANG，为构建组织工程化面神经支架和面神经损伤临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及相关仪器

1.1.1 实验动物 成年新西兰大耳白兔5只，雌雄不限，体质量为2.5～3.0 kg，动物的养护及处理均已获得滨州医学院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂及相关仪器 Triton X-100(Sigma公司)，3%脱氧胆酸钠，DNase I，RNase，Roche公司的DNA提取试剂盒，Invitrogen公司的dsDNA检测试剂盒。主要仪器为振荡器，光学显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 同种异体面神经基质供体的制备 室温下，10%水合氯醛0.5 mL/100 g对新西兰大耳白兔进行腹腔注射麻醉，在无菌条件下，在兔耳根下方做弧形切口，自耳下腺浅叶前缘向口轮匝肌方向分离浅筋膜，暴露双侧面神经，将神经外膜上附着的结缔组织去除，用缝合线结扎神经段两端，取一段神经，注意动作轻柔，将这段神经修剪成长度为2 cm的节段。将神经段在无菌蒸馏水中浸泡12 h。在4% TritonX-100中消化12 h，蒸馏水漂洗3 h，在3%脱氧胆酸钠中持续振荡消化12 h，振荡速率为120次/min，蒸馏水漂洗3 h，在DNase I和RNase 混合液中消化10 h，蒸馏水漂洗过夜。以上步骤完成后，将制备的面神经基质供体置于PBS(0.01 M，pH 7.4)中，在4℃下保存备用。

1.2.2 HE染色 取面神经基质供体用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.3 DNA残留量检测

1.2.3.1 DNA提取 采用美国Roche公司的DNA提取试剂盒提取脱细胞面神经基质和正常面神经内的DNA，DNA风干孵育再水化，在4℃下保存备用。

1.2.3.2 DNA定量 采用美国Invitrogen公司的dsDNA检测试剂盒检测提取的 DNA含量。根据所测样品DNA浓度计算标本DNA含量，以ng/mg干重表示。所有实验重复5次。

1.2.4 ANG的细胞毒性检测 以HDMEM为浸提介质，按0.2 g神经材料∶1 mL培养基的比例，在37℃条件下浸提72 h，制备神经材料浸提液。以无毒性聚乙烯片为阴性对照组，苯酚为阳性对照组，HDMEM培养基为空白对照组，在同等条件下制备浸提液，加入10%胎牛血清备用。取指数生长期MC3T3-E1兔神经细胞，浓度调整为1×105个/mL，按100 μL/孔接种到96孔细胞培养板，在37℃，5% CO2，饱和湿度细胞培养箱中培养24 h，用无菌PBS平衡液洗涤96孔细胞培养板中的细胞2次，换用各组浸提液继续培养，在浸提液培养的第1、3、5和7 d，加入CCK-8检测试剂10 μL，在培养箱中孵育6 h后，在450 nm波长条件下应用酶标仪检测吸光度值(OD值)，检测存活细胞的数量。浸提液在制备后48 h内应用，在每个检测时间点，每组样品检测5个平行样本，并计算细胞相对增殖率，根据细胞相对增殖率结果对各组神经基质的细胞毒性进行分级，见表1。

表1 神经基质的细胞毒性分级标准

2 结果

2.1 面神经基质供体的制备及形态学观察 面神经基质供体呈圆柱形，奶白色，略透亮，断端平整，长度较原神经段略变短，直径较正常神经稍小，柔软有韧性，弹性与正常神经基本一致，见图1A。

2.2 HE染色检测脱细胞程度 未萃取的新鲜神经可见神经轴突、施万细胞、成纤维细胞以及散在分布的血管。经化学萃取法获得的神经支架移植体纵切片HE染色图像显示，细胞结构已彻底去除，未见神经髓鞘及轴突结构，正常神经结构消失，红染的细胞外基质形成纵向排列结构，神经内膜呈波浪状，结构之间可见空隙，见图1B。

2.3 ANG的DNA残留 采用Ouant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒进行ANG支架内残留DNA 的定量分析，所建立的Lambda DNA标准品浓度与荧光信号值的回归方程为：荧光信号值=15.24+36.47×DNA浓度，标准曲线见图2。残留DNA定量分析结果显示，正常兔面神经内的DNA含量为(1 137.6±145.9) ng/mg，而兔ANG支架内残留的DNA含量为(27.4±15.6) ng/mg，较正常兔面神经明显下降，P<0.01，见图3。

图2 Lambda DNA标准品浓度与荧光信号值的标准曲线

**P<0.01

图3 兔ANG供体与正常兔面神经内的DNA含量

2.4 ANG的细胞毒性 根据表1神经基质供体的细胞毒性分级标准，采用MTT法检测兔神经细胞与面神经基质供体的细胞毒性。在各时相点被评为0级或1级，表明无细胞毒性。

3 讨论

由于面神经解剖结构的特殊性，面神经损伤的修复相对其他周围神经损伤修复更加困难。自体神经移植是修复周围神经缺损的金标准，但自体神经来源有限，且手术部位和创伤易造成神经支配区功能障碍，常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。组织工程相关技术的发展为治疗周围神经损伤提供了新的途径，其策略是构建支架材料负载种子细胞或细胞因子，或构建具有和神经相似三维结构和生物活性的复合体[3]。组织工程神经支架应具备良好的组织相容性、种子细胞生长和神经再生的三维空间结构及与神经再生速度相匹配的降解速度。目前常用的支架材料包括天然和人工合成材料类，天然材料主要是有自体、同种或异种神经、血管等。脱细胞神经支架制备材料可来源于同种异体神经，也可来源于异种异体神经。异种异体脱细胞神经支架具有天然神经的三维空间结构，供体来源广泛，但很难去除其免疫源性[4]。以同种异体神经天然材料为基础构建的组织工程神经支架材料以其良好的组织相容性成为研究热点。

本研究在前期工作的基础上，用Triton X-100、3%脱氧胆酸钠、DNase I、RNase的化学萃取法获得面神经支架移植体，HE染色提示，该支架移植体去除了髓鞘和轴突等抗原成分，而保留了完整的细胞外基质结构，从而获得了完整的三维立体支架。神经免疫源性主要来自于其中的细胞，荧光分光光度计测定支架内细胞经Quant-iT PicoGreen工作液染色后的DNA含量，结果显示，兔ANG支架内残留的DNA含量较正常兔面神经明显下降，提示神经中的细胞已基本被去除，该方法制备面神经支架去除细胞更彻底，表明所制备的面神经基质支架移植体免疫源性明显降低。

细胞毒性试验是检测生物材料细胞相容性最重要的指标之一，MTT法为最常用且获得公认的检测细胞毒性的方法，具有灵敏度高、定量客观、可重复等特点。本研究MTT法检测结果显示，所制备的神经基质供体基本无细胞毒性，提示该方法制备的面神经基质支架的组织相容性较好，可满足植入性医用材料的细胞毒性要求[5]。

新鲜神经存在一定的抗原性，其中抗原性最强的是施万细胞，三重膜性结构及施万细胞的基底膜管的抗原性较弱[6]。因此，保留物理性支架，再移植自体种子细胞于其中，就可以得到与天然神经结构相似又具有生物活性的神经移植体，这是组织工程化周围神经移植体的理想模式[7]。因此，本研究中改良的化学萃取法可有效去除面神经细胞，天然结构保存完好，细胞毒性低，可作为组织工程化面神经的支架。