苯并芘代谢产物BPDE的细胞毒性研究及五味子乙素在预防HTR-8/SVneo细胞损伤中的作用

梁婧，侯海燕，王梦，孙旸，陈亚琼

随着经济全球化进程的不断推进，空气污染在过去的几十年中已然成为大多数工业化国家或非工业化国家主要的危害健康的问题[1]。其中，多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类广泛存在于水、大气、植物、土壤中的持久性环境污染物，可透过胎盘对母体及胎儿产生毒性作用[2-3]，并对人胎盘细胞产生明显的抑制作用，促进其凋亡[4]。苯并（a）芘[benzo（a）pyrene，BaP]是典型的多环芳烃类环境污染物之一，可经由呼吸、饮食等多种途径进入母体并透过胎盘屏障，在胚胎发育过程中通过氧化损伤和凋亡等途径产生胚胎毒性，进而影响胚胎的正常发育[5]。已有研究证实BaP可诱导子宫内膜细胞的凋亡，进而破坏子宫内膜功能，发挥生殖毒性作用[6]。本课题组前期的多项研究也已证实BaP对早孕期大鼠产生胚胎毒性，与胚胎发育异常、胎停育、胚胎组织过度凋亡及氧化损伤等不良妊娠结局密切相关[7-9]。二氢二醇环氧苯并芘[7，8 dihydrodiol 9，10 epoxidebenzo（a）pyrene，BPDE]作为BaP的内分泌干扰物和最终致癌产物，不仅可干扰正常妊娠导致胎儿生长受限、流产，并与先兆子痫等滋养细胞疾病息息相关[10]，还可引起子代染色体的异常，诱发胎儿出生缺陷[11]。五味子始载于《神农本草经》，是久负盛名的食药两用滋补类中药。从五味子中提取的有效成分五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）也因其显著的药理作用而被广泛认知。已有研究证实，Sch B可以通过抑制P53信号通路来减轻体内炎性反应、氧化应激和凋亡，从而发挥对细胞的保护作用[12]。此外，Sch B还能显著改善氧化应激、线粒体膜电位去极化和血管紧张素Ⅱ诱导的细胞凋亡，这些抗氧化作用可能是通过诱导Nrf2通路来介导实现的[13]。

本研究旨在以人绒毛膜外滋养细胞株HTR-8/SVneo为研究载体，构建BPDE细胞染毒模型和Sch B细胞保护模型，探讨BaP代谢产物的细胞毒性效应，同时也探索Sch B的细胞保护作用，阐明多环芳烃类化合物的生殖毒性，为临床开发安全、有效的环境污染防护剂奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料 人绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo由加拿大多伦多大学Graham教授惠赠并经相关鉴定，BPDE（加拿大TRC公司），Sch B（中国药品生物制品检定所），1640培养基（北京索莱宝生物技术有限责任公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），0.25%胰酶消化液（北京索莱宝生物科技公司），二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝生物科技公司），MTS细胞增殖检测试剂盒（美国Promega公司），CO2培养箱（法国Jouan公司，TG-150），BX51型倒置荧光显微镜及成像[1]系统（日本OLYMPUS公司），酶联免疫分析仪（台湾METERTECH公司）。

1.2 细胞培养 HTR-8/SVneo细胞接种于细胞培养皿中，加入RPMI 1640完全培养基7 mL后置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。根据细胞生长情况适时进行换液、传代、冻存及MTS细胞增殖实验。

1.3 细胞生长曲线的测定 ①取对数生长中晚期细胞，用胰酶消化，离心收集后用新培养基制成细胞悬液后计数；②根据细胞计数结果按每培养瓶5×104/mL作传代培养接种细胞，分别接种21瓶细胞；③接种24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数1次，每次取3瓶细胞，分别进行计数，计算平均值，连续记数7 d；④计数前取少量细胞悬液以1∶1的比例进行0.5%台盼蓝染色以计数活细胞的数目，低倍镜下计数台盼蓝拒染的细胞（未着色的细胞）即活细胞；⑤根据细胞计数结果，以单位细胞数（细胞数/mL）为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线。

1.4 MTS细胞增殖实验 ①收集对数生长期细胞，用RPMI 1640完全培养基配制成单细胞悬液，计数；②以每孔2×103个细胞接种于96孔板中，正常培养72 h后加药，设定BPDE及Sch B的浓度梯度，同时设置细胞对照组和空白对照组，各组细胞的每个剂量设3个复孔，每孔体积200 μL，在37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养48 h，培养板周边孔接种等量无菌PBS，以避免边缘效应干扰实验；③将每孔的培养基吸出，加入100 μL/孔新鲜培养基，每孔加MTS试剂20 μL，在37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养4 h，振荡10 min；④酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（单波长490 nm），记录结果，计算各药物浓度下的细胞存活率，细胞存活率=[（实验孔-空白孔）/(对照孔-空白孔)]×100%，；⑤用改良寇氏法计算各组细胞对BPDE半数抑制浓度，并根据标准曲线确定染毒浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析处理。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时进一步两两比较采用LSD-t法，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验进行两两比较；不符合正态分布的定量资料采用中位数和四分位数 [M（P25，P75）]表示，组间比较采用秩和检验。所有检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长曲线的绘制 HTR8/SVneo细胞的对数生长期为第3～5天，所以选择在此期间加药，进行后续实验。见图1。

图1 HTR8/SVneo细胞的生长曲线

2.2 不同浓度及不同时间点BPDE和Sch B对HTR8/SVneo细胞形态的影响

2.2.1 不同浓度BPDE处理HTR8/SVneo细胞24 h后细胞形态在倒置显微镜下观察，经不同浓度梯度BPDE处理24 h后，未经药物处理 （0 μmol/L）的HTR8/SVneo细胞呈现梭形，大小均一，细胞壁光滑，折光性好。与未经药物处理细胞相比，随着药物BPDE浓度的增加，细胞出现不同程度的药物毒性作用。见图2。

2.2.2 不同浓度BPDE处理HTR8/SVneo细胞48 h后细胞形态经不同浓度BPDE处理48 h后，HTR8/SVneo细胞多数失去正常的形态，细胞死亡明显。见图3。

2.2.3 不同浓度BPDE处理HTR8/SVneo细胞72 h后细胞形态经不同浓度梯度BPDE处理72 h后，HTR8/SVneo细胞失去正常的形态，大部分坏死，脱壁死亡。见图4。

2.2.4 不同浓度Sch B处理HTR8/SVneo细胞24 h后细胞形态在倒置显微镜下观察未经药物处理（0 μmol/L）的HTR8/SVneo细胞发现，细胞呈梭形，大小均一，细胞壁光滑，折光性好。与未经药物处理细胞相比，药物处理24 h后，不同浓度Sch B处理的细胞未出现明显的毒性作用。见图5。

2.2.5 不同浓度Sch B处理HTR8/SVneo细胞48 h后细胞形态经不同浓度Sch B处理48 h后，HTR8/SVneo细胞形态大致正常，未出现明显的毒性作用，但细胞生长较24 h缓慢。见图6。

2.2.6 不同浓度Sch B处理HTR8/SVneo细胞72 h后细胞形态经不同浓度梯度Sch B处理72 h后，HTR8/SVneo细胞形态大致正常，毒性作用不明显。见图7。

图2 不同BPDE浓度处理HTR8/SVneo细胞24 h对细胞的影响 （×100）

图3 不同BPDE浓度处理HTR8/SVneo细胞48 h对细胞的影响 （×100）

2.3 BPDE建立HTR8/SVneo细胞染毒模型 根据上述各时间点染毒后细胞形态的变化，结合HTR8/SVneo细胞的对数生长周期，用不同浓度BPDE 1.5625～50 μmol/L处理HTR8/SVneo细胞24 h后，采用MTS法检测HTR8/SVneo细胞活力，结果显示随着BPDE处理浓度的增高，细胞存活率明显下降，且与未药物处理细胞相比差异均有统计学意义（均P＜0.001）。计算得出BPDE的IC50≈3.54 μmol/L，通过制作标准曲线，选取5 μmol/L（约为IC60）为BPDE的最终染毒浓度，以此剂量建立HTR8/SVneo细胞染毒模型。见图8。

图4 不同BPDE浓度处理HTR8/SVneo细胞72 h对细胞的影响 （×100）

图5 不同Sch B浓度处理HTR8/SVneo细胞24 h对细胞的影响 （×100）

2.4 Sch B抑制BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞活力下降 先用1.25～20 μmol/L Sch B预处理细胞24 h，然后再用5 μmol/L BPDE处理24 h。BPDE使细胞活力显著下降，活细胞数仅占总细胞数的38.23%，经不同浓度的SchB（0.625、1.25、2.5、5、10和20μmol/L）预处理后再以BPDE进行干预，细胞活力明显上升，细胞存活率分别为40.11%、42.68%、46.47%、47.34%、61.37%和49.87%，其保护作用在0.625～10 μmol/L呈浓度依赖关系。因此，Sch B（0.625～10 μmol/L）对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞活力下降有显著的抑制作用，可选取10 μmol/L为Sch B终干预剂量，并以此剂量建立HTR8/SVneo细胞保护模型。见图9。

图6 不同Sch B浓度处理HTR8/SVneo细胞48 h对细胞的影响 （×100）

图7 不同Sch B浓度处理HTR8/SVneo细胞72 h对细胞的影响（×100）

图8 BPDE对HTR8/SVneo细胞活力的影响

图9 Sch B对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞活力的影响

3 讨论

HTR8/SVneo细胞系被认为是最接近滋养层细胞的研究模型，其来源于人早孕（8～10周）绒毛组织，进行体外原代培养，通过转染猿猴病毒40T抗原（SV40）质粒而构建的永久传代绒毛膜外滋养层细胞[14]。人绒毛膜外滋养层细胞是与母体血液首先接触的胚胎细胞，在滋养细胞迁移黏附、胚胎着床、母婴物质交换、胚胎免疫耐受等方面具有重要的生理意义[15]。其功能异常可导致早产、流产、胚胎停育、胚胎发育异常等不良妊娠结局。前期本课题组成员发现一定浓度的BaP对HTR8/SVneo细胞株产生毒性作用[16-19]，这种毒性作用及致癌作用并不直接，而是需要经过机体内混合功能氧化酶激活才具有致癌性。BaP在体内首先经混合功能氧化酶细胞色素P450酶1A1（CYP1A1）催化形成7，8环氧苯并芘，然后在环氧化物酶和CYP1B1的作用下形成7，8二氢二醇苯并芘，该物质经混合功能氧化酶催化形成BPDE这种致癌活性最强的代谢中产物。BPDE能够结合体内的DNA、蛋白质等生物大分子形成共价化合物，造成DNA损伤，成为BaP在体内的最终致癌物质[20-21]。因此，在离体实验中应用BPDE这种BaP的代谢终产物直接染毒研究BaP的毒性是较为合理的。但是，由于BPDE是强致癌物，属于国家管制类化学制剂，获取途径较为困难，且价格昂贵，故目前的文献中对BPDE的报道相对较少。本研究利用MTS细胞增殖实验检测BPDE对HTR8/SVneo细胞增殖的影响，结果发现用不同浓度1.5625～50 μmol/L处理HTR8/SVneo细胞24 h后，各个浓度均抑制了细胞的增殖，且毒性作用逐渐增强，呈现浓度依赖状态。可见BPDE对HTR8/SVneo细胞产生了毒性作用，抑制其生长，改变细胞形态。有学者将人滋养细胞swan71分别暴露于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 和 4 μmol/L 不 同 浓 度 的BPDE中，作用12、24和48 h后采用MTT比色法检测细胞活力，发现2 μmol/L BPDE暴露24 h细胞活力下降到44%±5%，1 μ mol/L BPDE暴露48 h细胞活力下降到45%±3%[22-23]。这与本研究发现的BPDE对HTR8/SVneo细胞株的IC50（3.54 μmol/L）趋势大致相同，且均在1.5 μmol/L BPDE染毒后细胞活力降至60%左右，进一步证实了本研究的可靠性，而染毒浓度的微小差异可能与这两项研究中细胞株的生长特性及检测方法不同有关。此外，本研究最终选取5 μmol/L（约为IC60）为BPDE的终染毒剂量，是由于在本课题组的前期预实验已证实了Sch B HTR8/SVneo细胞的保护作用，故选取较IC50稍大的剂量染毒，以便更直观地阐明并展示Sch B对细胞的保护力。

本研究将HTR8/SVneo细胞暴露于不同浓度的Sch B（0～50 μmol/L）24 h、48 h及72 h，未见明显细胞毒性，仅于48 h后见细胞生长较24 h稍缓慢。本研究旨在检测Sch B与BPDE联合给药后对细胞的作用，故以1.25～20 μmol/L Sch B预处理细胞24 h，然后再5 μmol/L BPDE处理24 h。BPDE染毒后细胞活力显著下降，而经不同浓度的Sch B（0.625、1.25、2.5、5、10和20 μmol/L）预处理后再以BPDE进行干预，细胞活力明显上升，细胞存活率分别为40.11%、42.68%、46.47%、47.34%、61.37%和49.87%，其保护作用在0.625～10 μmol/L呈浓度依赖关系。因此，Sch B（0.625～10 μmol/L）对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞活力下降有显著抑制作用。当Sch B浓度＞10 μmol/L时，Sch B与BPDE联合给药则细胞活力逐渐下降，考虑Sch B的细胞保护作用也是在适量浓度范围之内的，超剂量的Sch B依然有一定细胞毒性作用。

综上所述，本研究首次证实了BaP的代谢产物BPDE对人绒毛膜外滋养细胞株HTR-8/SVneo的毒性作用，同时也再次验证了Sch B对HTR-8/SVneo细胞株的保护作用，建立了人绒毛膜外滋养细胞株HTR-8/SVneo BPDE的染毒模型及Sch B的细胞保护模型，为进一步明确BaP的生殖毒性作用，深入阐明芳香烃类化合物毒性机制及深入挖掘五味子的药用价值埋下了伏笔，以期充分发挥Sch B对胚胎的保护作用，为临床开发安全、有效的环境污染防护剂奠定科学基础。