冻融胚胎移植发生生化妊娠的相关因素分析

马志渊，王丽媛，土增荣，田秀珠

经过近40年的发展，辅助生殖技术取得了显著进步。文献报道目前辅助生殖技术妊娠成功率可达50%以上，但其抱婴回家率仍维持在30%左右[1]，其中有一大类情况为生化妊娠。生化妊娠为早期妊娠丢失的一种，指胚胎开始着床，血或尿中的人绒毛膜促性腺激素（hCG）达到可检测水平，但随后行B超检测时于宫内及宫外均未探及明显孕囊或期间月经来潮，复查hCG值时提示升高不明显或呈下降趋势，其发病原因尚不明确。冻融胚胎移植（freezethaw embryo transfer，FET）作为辅助生殖技术中一种重要的治疗手段，能够减少患者促排卵次数，降低体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过程中并发症的发生风险，并提高剩余胚胎的利用率[2]。本研究旨在通过回顾性分析在行FET周期过程中发生生化妊娠的病例及临床妊娠成功分娩的病例，探寻发生生化妊娠的相关因素，以期在行FET时能够降低生化妊娠的发生，从而提高抱婴回家率，减少不孕症夫妇的心理及经济负担。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2012年1月—2016年10月在山西医科大学第一医院生殖中心行FET助孕治疗发生生化妊娠的病例120例作为研究组，同期临床妊娠并成功分娩的病例110例作为对照组。纳入标准：男方因素、女方合并输卵管因素、排卵障碍、多囊卵巢综合征（PCOS）和子宫内膜异位症等原因导致的不孕症患者。排除一些可能影响胚胎着床的因素如：子宫内膜息肉、宫腔粘连、子宫畸形等。本研究已征求患者的知情同意，且已通过我院生殖医学伦理委员会的审核。

1.2 方法

1.2.1 胚胎培养及冷冻IVF促排卵方案及受精方式参照我院生殖中心常规执行。胚胎质量分级：将受精后D3天胚胎根据其形态学进行分级，主要观察其卵裂球数目、对称性、细胞浆的形态、分裂产生的碎片等。Ⅰ～Ⅱ级胚胎卵裂球大小均匀，数目适当，无空泡，碎片无或者少，＜20%，统称优质胚胎或高评分胚胎；Ⅲ级胚胎，卵裂球大小明显不均匀，碎片为21%～50%。Ⅳ级卵裂球大小严重不均匀，有严重的颗粒现象，碎片50%。但根据其外观并不能完全反应胚胎的发展潜力，故将评分Ⅰ～Ⅲ级胚胎称为可利用胚胎，可行冷冻或移植[3]。将Ⅰ～Ⅲ级胚胎行玻璃化快速冷冻以备下次周期使用。

1.2.2 内膜准备内膜准备常有自然周期及人工激素替代周期。月经规律者可行自然周期，于月经周期第12天左右行阴道B超监测排卵及子宫内膜厚度，确定排卵后，于排卵后第5天行胚胎移植。在激素替代周期过程中于月经第3天给予口服戊酸雌二醇片（补佳乐）促进子宫内膜生长，B超检测子宫内膜厚度达8 mm时开始给予肌注黄体酮行内膜转化，肌内注射5 d后行胚胎移植[4]。

1.3 妊娠结局 移植后14 d行血hCG或尿hCG检测，确定妊娠后于移植后28 d行阴道B超，若未及明显孕囊，且复查hCG提示升高不明显或下降则表示为生化妊娠。若可探及宫内孕囊则为临床妊娠。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对所有数据进行分析，定量资料符合正态分布数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布数据用中位数和四分位数表示，组间比较采用秩和检验；定性资料用率表示，组间比较采用χ2检验；差异有统计学意义及有临床意义的因素采用Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 2组患者的基本情况比较

表2 2组患者的不孕因素及既往流产史比较 例（%）

2 结果

2.1 一般情况 研究组的血hCG值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2组女方年龄、身高、体质量、体质量指数（BMI）、男方年龄、不孕时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 不孕因素 2组输卵管因素、排卵障碍、多囊卵巢综合征（PCOS）、子宫内膜异位症、男方因素、双方因素及原因不明因素、自然流产史、人工流产史、异位妊娠史所占比例差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 2组内膜准备、受精方式、胚胎移植情况比较 2组内膜准备方式、受精方式及内膜厚度比较差异无统计学意义（P＞0.05），而2组移植胚胎数及移植周期中最少有1枚优质胚胎比例差异有统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.4 多因素回归分析 将上述有统计学意义的因素，移植胚胎数及移植中至少有1枚优质胚胎纳入Logistic回归分析。结合临床及一些文献报道考虑女方年龄、既往自然流产史、受精方式、移植日子宫内膜的厚度与妊娠结局有关，故同样将这些因素纳入回归方程进行分析。采用Enter法最后分析得出既往有自然流产史、移植胚胎数≥2枚、移植至少1枚优胚等因素与生化妊娠有关。在校正其他变量的情况下，既往有自然流产史者，生化妊娠发生的概率增加（OR=2.182，95%CI：1.058~4.501），差异有统计学意义（P＜0.05）；移植胚胎数≥2枚者较移植胚胎数＜2枚者，生化妊娠发生的概率降低（OR=0.081，95%CI：0.010~0.674），差异有统计学意义（P＜0.05）；移植至少有1枚优质胚胎，生化妊娠发生的概率降低（OR=0.473，95%CI：0.268~0.834），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 FET时子宫内膜准备方式、胚胎的受精方式、胚胎移植情况比较

表4 妊娠结局影响因素回归分析

3 讨论

近年随着辅助生殖技术的发展及我国二胎政策的放开，越来越多不孕症夫妇及有再次生育要求的夫妇寻求辅助生殖的帮助，辅助生殖技术更加广泛地应用于不孕症治疗中。但辅助生殖技术仍存在很多不足，抱婴回家率未能得到明显提升，妊娠早期丢失的情况仍需密切关注。本研究选用临床常见并易获取的指标，分析在FET过程中导致发生生化妊娠的相关因素。通过数据分析得出既往有自然流产史、移植2枚及2枚以上胚胎和移植胚胎中至少有1枚优质胚胎与生化妊娠有关，其中既往有自然流产史是生化妊娠的危险因素，移植胚胎数目≥2枚及移植优质胚胎是生化妊娠的保护因素。

文献报道，既往有自然流产史的患者再次妊娠时发生生化妊娠的风险更高。本研究中，尽管2组自然流产史比例差异无统计学意义，但纳入多因素回归分析后提示有自然流产史患者较无自然流产史者，生化妊娠发生的概率增加至2.182倍，即有过自然流产史的妇女更易发生生化妊娠，与文献报道结论一致[5]。研究认为有多次自然流产史的患者，可能存在染色体结构的异常或其存在内分泌水平及免疫功能紊乱，在未明确或纠正这些病因时，仍可能导致下次妊娠时再次发生早期的妊娠丢失。自然流产有宫腔残留可能，行清宫等宫腔操作时也可能导致子宫内膜的损伤，易形成内膜炎症及局部感染，使子宫内膜容受性降低，影响受精卵的着床及胚胎的发育，这也是导致发生生化妊娠的可能原因。也有研究表明，随着自然流产次数增加及患者对辅助生殖技术过高的期望，均会不同程度增加患者的心理负担，主要表现为精神焦虑。有数据显示，在第1次妊娠时有9.5%孕妇会发生焦虑，≥2次流产史的孕妇焦虑发生率高达62.5%[6]。妇女持续的焦虑状态会降低胚胎着床率，增加生化妊娠的发生。但在龚衍等[7]的研究中则显示既往有过自然流产史不会导致生化妊娠的发生，认为在行FET前已经做了充分的检查，针对一些导致自然流产的病因进行了预先治疗。因此，建议对于既往有自然流产史的患者在行IVF治疗前宜积极寻找病因，根据病因采取不同的治疗方案，预先消除影响因素来减少生化妊娠的发生。

目前关于ICSI受精方式是否会影响胚胎着床及导致生化妊娠尚未明确。有文献提示ICSI操作不会增加FET过程中生化妊娠率的发生，认为在行FET时，胚胎经过冷冻、复苏，并且给予充足的黄体支持，ICSI操作时导致对胚胎的影响可能已经被弱化。本研究同样显示受精方式在2组间差异无统计学意义，与龙文等[5]研究相似。而一些研究者认为使用ICSI受精方式的患者本身即存在精子或卵子严重缺陷，使其形成的胚胎发育不良，且ICSI在操作过程中易损伤到卵母细胞的纺锤体及卵细胞胞浆，增加了非整倍体和染色体异常的风险，导致生化妊娠的发生。同时行辅助生殖过程中，应严格掌握ICSI的使用指征，有研究指出ICSI操作没有经过自然受孕的生理选择，一些存在有基因缺陷的精子不可避免地将遗传物质传给子代，或可能导致早期妊娠丢失或先天缺陷甚至胎儿畸形。因此，还需要进一步扩大样本量继续研究。

有关胚胎移植数目通常参照我国原卫生部2003年制定的《人类辅助生殖技术规范》，规定“每周期移植胚胎总数不得超过3个，其中35岁以下妇女第1次助孕周期移植胚胎数不得超过2个”[8]。张雪等[9]研究发现移植冷冻解冻胚胎为1枚时妊娠率为9.29%、2枚为19.21%、3枚及以上为37.32%。本研究结果显示当移植胚胎数≥2时，能降低生化妊娠的发生，与以上研究相近。但有研究表明移植3枚胚胎并不会提高妊娠率的发生，与移植2枚胚胎时妊娠结局无差异，认为可能与胚胎的质量有关。随着移植数目的增多，妊娠率提高，但多胎率也随之提高，多胎妊娠会增加母婴围生期并发症的发生。因此，在行FET时应根据患者自身情况来控制胚胎数量的移植，以期在增加临床妊娠率的同时能够降低生化妊娠及多胎率的发生。

生化妊娠与移植优质胚胎是否相关目前尚不明确，我中心目前还未施行单胚胎移植，不能很准确地比较移植单个优质胚胎与未移植单个优质胚胎哪个更易获得临床妊娠，因此在本研究中选取移植中至少有1枚优质胚胎作为观察对象，发现移植胚胎中至少有1枚优质胚胎时能够降低生化妊娠的发生。而有的研究显示生化妊娠与是否移植优质胚胎无明显关系，认为通过观察胚胎形态情况来评估卵子质量，不能评价出胚胎染色体是否存在异常，尽管形态学表现为正常的胚胎，但其染色体发生异常的概率仍高达32.8%[10]，因此还需要进一步研究。

综上，目前在FET过程中导致生化妊娠发生的原因尚未明确，可归因于与人类生殖有关的几个因素，包括遗传、胚胎质量（主要是非整倍体的增加有关）、内分泌情况和免疫功能水平、感染因素、环境污染物、心理遗传因素等。在本研究中生化妊娠与既往自然流产史、移植胚胎数目≥2枚及移植胚胎中是否有优质胚胎有一定相关性。一些研究中还提到生化妊娠还与女性年龄有关，随着年龄的增长，卵巢储备功能的降低及卵子质量的下降，染色体异常增加及子宫内膜容受性降低，均增加了生化妊娠的发生。因此，在行辅助生殖技术时，要重视患者的年龄，严格遵循ICSI使用指征，选择优质的胚胎进行移植。同时在备孕前也需要纠正患者一些基础的内分泌疾病及免疫系统疾病，提高妊娠率和减少生化妊娠的发生。