MTHFR基因C677T及A1298C多态性与自然流产的关系

黄中秀，李小兰，李小松

(重庆市黔江中心医院检验科，重庆 409000)

自然流产指妊娠28周内非人为因素导致的流产，胎儿体重低于1 000 g，其发生机制尚不明确，主要与遗传、内分泌异常、感染等因素有关，临床上约50%的自然流产原因难以明确[1-3]。叶酸为核酸合成、细胞生长、胚胎发育的重要物质，不仅能预防新生儿出生缺陷(如唇腭裂)，还可减少自然流产的发生[4]。有学者指出，孕早期血清叶酸水平可能影响妊娠结局[5]。叶酸代谢障碍可能增加心脏畸形、肢体畸形等出生缺陷以及妊娠期高血压等并发症的发生率[6]。目前尚无叶酸代谢障碍的标准定义，临床常通过基因多态性检测进行判断。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因是叶酸代谢相关基因之一，研究发现，MTHFR基因C677T位点突变是自然流产发生的危险因素[7-8]。由此可见，体内叶酸水平可能与自然流产有关。本研究通过检测自然流产患者体内叶酸、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平以及MTHFR基因C677T、A1298C多态性，探讨叶酸相关MTHFR基因C677T、A1298C多态性与自然流产的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年10月至2017年6月在重庆市黔江中心医院妇产科就诊的150例自然流产患者作为观察组，选择同期230名门诊常规孕检正常妊娠女性作为对照组。观察组纳入标准：①妊娠28周内非人为因素导致的妊娠终止，胎儿体重1 000 g以内；②年龄18～40岁；③内分泌功能和生殖器结构正常者；④初中及以上文化程度。所有受试者临床资料完整，均排除器质性病变、生殖道感染、夫妻双方染色体异常、既往自然流产史等因素，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料收集 收集受试者相关临床资料，包括年龄、孕周、分娩史、体质指数(body mass index，BMI)、叶酸使用情况等。

1.2.2血清叶酸、Hcy水平检测 采集受试者清晨空腹外周静脉血2 mL，离心机分离后将血清保存于-20 ℃冰箱内待测。采用直接化学发光法通过化学发光免疫分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司，UniCel DxI 800)检测血清叶酸水平，采用循环酶法全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BS-350)检测血清Hcy水平。

1.2.3MTHFR基因C677T、A1298C多态性检测 采集外周静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管，采用柱式DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司，批号：69504)对样本DNA进行提取，使用Taqman-MGB探针(美国ABI公司)检测MTHFR基因C677T、A1298C位点，C677T、A1298C引物序列分别为GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG、CTCCCGCAGACCTTCTCCTTCAA、AAGAACGAAGACTTCAAAGACTT、CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA。反应体积10 μL(2X MasterMix、去离子水、DNA模板、20X引物分别为5 μL、3.5 μL、1 μL、0.5 μL)。反应条件：95 ℃预变性10 min后，于92 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s进行20个循环扩增，再行89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s 30个循环扩增。完成后使用荧光定量聚合酶链反应仪(美国应用生物系统公司，ABI 7900型)读取终点荧光，MTHFR C677T包括CC、CT、TT三个基因型。

2 结 果

2.1两组临床资料比较 观察组与对照组年龄、孕周、分娩史、BMI比较差异均无统计学意义(P>0.05)；观察组围孕期叶酸使用率低于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 两组临床资料比较

BMI：体质指数；对照组：正常妊娠者；观察组：自然流产者；a为t值，余为χ2值

2.2两组血清叶酸、Hcy水平比较 观察组血清叶酸水平低于对照组，血清Hcy水平明显高于对照组(P<0.01)，见表2。

组别例数叶酸(μg/L)Hcy(μmol/L)对照组23010.92±4.159.37±2.95观察组1508.76±2.1211.68±3.06t值5.8917.352P值<0.001<0.001

Hcy：同型半胱氨酸；对照组：正常妊娠者；观察组：自然流产者

2.3两组MTHFR基因C677T多态性比较 两组MTHFR基因C677T位点基因型分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验(χ2=0.001，P>0.05)，提示样本具有群体代表性。观察组MTHFR基因C677T的TT基因型、T等位基因频率高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组MTHFR基因C677T基因型、等位基因频率比较 [例(%)]

MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶；对照组：正常妊娠者；观察组：自然流产者

2.4两组MTHFR基因A1298C多态性比较 两组MTHFR基因C677T位点的基因型分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验(χ2=1.056，P>0.05)，提示样本具有群体代表性。观察组与对照组MTHFR基因A1298C基因型、等位基因频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 两组MTHFR基因A1298C基因型、等位基因频率比较 [例(%)]

MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶；对照组：正常妊娠者；观察组：自然流产者

3 讨 论

自然流产对女性生理及心理健康均可造成不同程度的影响，还关系到其家庭和谐。近年来，由于工作环境(如美容美发行业接触染发剂、烫发剂等化学试剂)、生育史(既往流产、多次妊娠)、生育政策(二胎政策)、生育年龄偏高等因素的影响，自然流产的发生率有升高趋势，因此受到广泛关注。赵雪芬和王静[9]通过Logistic多因素回归分析发现，自然流产的独立危险因素包括高龄、孕期阴道出血、孕期感染、有不良妊娠史等，而孕期叶酸补充是自然流产的保护因子。朱烨[10]研究发现，孕前BMI偏低、文化程度较低、既往流产史是发生不明原因自然流产的危险因素，而围孕期口服叶酸、血清高叶酸水平是其保护因素。由此可见，血清低叶酸水平可能增加自然流产的发生风险。研究发现，复发性流产患者血清叶酸水平偏低，口服叶酸后其叶酸代谢异常明显好转，早期复发流产的发生率降低，改善了患者的妊娠结局[11]。

叶酸为人体必需的营养物质之一，具有不耐热、分子量低的特点[12-13]。绿色蔬菜、水果等食物中叶酸的含量较多，但食物加工过程可导致叶酸的破坏。此外，代谢产物、肠道环境等因素也可不同程度地影响叶酸的吸收，故食物中叶酸的生物利用度较低。妊娠期女性对叶酸的需求较未妊娠时升高2～4倍，因此孕期叶酸的补充十分必要[14-15]。我国女性备孕前3个月、孕早期3个月需补充叶酸400 μg，但受个体体质的影响，临床上孕妇叶酸缺乏仍较常见[16]。Hcy为蛋氨酸、半胱氨酸代谢的中间产物，被认为是一种神经毒性物质，血清高Hcy水平易致畸，还可导致胎儿凝血/抗凝系统异常和胎盘栓塞，最终引起胎儿死亡[17-18]。何可人等[19]研究显示，自然流产患者血清叶酸水平较正常妊娠女性显著降低，而血清Hcy水平显著较高，提示低叶酸水平、高Hcy水平可能是妊娠期发生自然流产的危险因素，本研究与其研究结果一致，故建议妊娠女性围孕期适当补充叶酸，以预防自然流产的发生。

叶酸在人体DNA的合成及甲基化中发挥重要作用，妊娠女性叶酸代谢障碍可能导致自然流产、唐氏综合征等相关疾病的发生[20]。叶酸代谢障碍可能与叶酸代谢相关酶基因多态性异常变化有关[21-23]。MTHFR是叶酸代谢过程的关键酶之一，定位于1p36.32，由656个氨基酸组成，可将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸可为细胞内基因甲基化提供原料，是细胞内基因甲基化开始的重要标志，在甲硫氨酸合成酶作用下，5-甲基四氢叶酸与维生素B12结合，促使血浆Hcy的再甲基化。

C677T、A1298C是临床较常见的MTHFR基因位点，其中C677T位点突变即核苷酸上胞嘧啶C突变成胸腺嘧啶T，缬氨酸序列上丙氨酸转变成缬氨酸，导致基因型表达蛋白酶活性下降，耐热性降低，进而促使血清叶酸水平下降以及Hcy水平升高，并对血管内皮细胞造成不同程度的损害，促使血小板聚集，从而引发胎盘病变，最终导致流产[24-26]。临床上，常通过检测MTHFR C677T基因型判断机体叶酸代谢障碍情况，其中CC型表示蛋白酶活性高，叶酸转化能力正常，高Hcy血症发生风险低等；CT型表示蛋白酶活性及叶酸转化活动能力中等，高Hcy血症发生风险中等；TT型表示蛋白酶活性低，叶酸转化能力低下，高Hcy血症发生风险较高。本研究结果显示，观察组MTHFR C677T的TT基因型、T等位基因的频率均较对照组显著升高，提示MTHFR C677T基因位点突变可能参与自然流产发生，C677T可使杂合子基因型、纯合子基因型内一种热不稳定蛋白酶的活性分别下降35%、70%，易导致Hcy水平升高，进而损害血管内皮细胞，引起血小板聚集，导致流产风险增加。A1298C分布在MTHFR基因第7外显子，其突变会导致MTHFR还原酶活性下降，但其对自然流产的影响较MTHFR C677T基因位点突变小。郁长治等[25]研究发现，新疆维尔族女性自然流产与MTHFRC677T、MTRRA66G有关，而与A1298C基因位点突变无关，本研究结果与上述研究相符。关于MTHFRC其他基因型以及其他基因对自然流产的影响仍需进一步深入研究。

影响自然流产的因素较多，如年龄、既往自然流产史等，本研究排除既往自然流产史病例，同时选取年龄、孕周、BMI、分娩史相匹配的正常妊娠女性作为对照，避免了上述因素对研究结果的影响。但叶酸代谢障碍相关基因多态性存在地区分布的特点，关于不同地区叶酸代谢障碍相关基因多态性对自然流产的影响尚有待进一步多中心、大样本的研究。

综上所述，自然流产患者血清叶酸水平较低，Hcy水平较高，MTHFR C677T可能与自然流产相关，而A1298C与自然流产无关。围孕期女性应常规补充叶酸，以减少自然流产的发生，提高妊娠成功率；妊娠早期需检测血清叶酸、Hcy水平，并根据检测结果合理补充叶酸。