小鼠组织石蜡切片制作中的问题探讨

李汝佳 孙艳芹 甘思远

（1 广东医科大学病理学系 广东 湛江 524023）

（2 广东医科大学病理学系 广东 东莞 523808）

石蜡切片技术是形态学和病理学研究领域中最基本的研究手段，是组织病理学制片技术中最常用的方法，在科研工作中多需要对小鼠的组织做石蜡切片。而小鼠的组织较人体组织块小质嫩柔软，若按照跟人体组织一样的制作方法，会使小鼠变硬变脆，所以通过不断的实验，依据不同组织结构特点和组织学性质的差异，在制作石蜡切片时对其每个步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等选择各自适宜方法，才能做出高质量的切片，如果在任何一个环节上出现失误都会影响到切片的质量，最终影响对结果的判断。

我们总共取了小鼠的脑、肺、心脏、肝脏组织做实验，在制作切片的过程中对遇到的问题进行探讨，寻找到正确的解决方法。现总结如下。

首先，对小鼠脑、肺、心脏、肝脏组织要充分的固定。固定液常用40%的甲醛和水按1 ∶9 配制成10%甲醛溶液，这是最简便、经济的固定液。处死小鼠后取出脑、肺、心脏、肝脏组织先用生理盐水冲洗一下，尽可能清除掉无用的黏连组织，不可以挤压组织，然后迅速放到固定液中，使组织细胞迅速凝固，防止组织的腐败和自溶。固定液的量一般要为组织的10 倍，才能使其充分固定，根据组织的大小来确定固定时间，一般为l2 ～24 小时。

其次，要严格控制小鼠的脱水、透明、浸蜡的时间以及每个步骤的注意事项。脱水剂常用乙醇，脱水的时候酒精要按照低浓度到高浓度酒精进行梯度脱水。如脱水时间不足，会造成组织发软、凹陷。可脱水时间过长，则会造成组织过硬。脱水剂要经常更换，避免长时间使用会使脱水剂的浓度不达标，从而造成组织脱水不良。如不能及时完成脱水过程，组织可在低浓度的乙醇中放置时间长点，但不能在无水乙醇内放置时间过长。透明剂使用二甲苯的效果最好，但应严格控制其时间。时间不够使组织不能完全透明，乙醇不能被完全置换出来，导致下一步的浸蜡中，石蜡不能浸透到组织中[1]。但在二甲苯中时间过长则会导致组织变硬变脆，切片时不易切出完整的切片。浸蜡所使用的石蜡熔点是58℃，时间同样不可以过长，因为石蜡对组织也有一定的收缩作用。浸蜡的温度也不宜过高，控制在六十度，否则都会使组织变硬。

应视组织的性质类型及其大小分别安排脱水时间。脑组织其含水分多纤维成分少，透明、浸蜡的时间都要延长。心肺组织因柔软疏松故脱水时间也应延长。而实质性器官肝组织因其结构紧密，所以其在脱水，透明、浸蜡的时间要比跟其他组织都要时间短，尤其是高浓度酒精容易使组织收缩和硬化，所以不能脱水时间过长，否则组织变硬变干，组织切下来就变成粉末，切片破碎，变成空洞或不成形[2]。

通过多次实验，我们将实验动物小鼠脑、肺、心脏、肝脏组织的脱水、透明、浸蜡等所需的具体的适宜时间介绍如下，见表。

表 小鼠脑、肺、心脏、肝脏组织脱水、透明、浸蜡时间

最后，小鼠脑、肺、心脏、肝脏组织在包埋、切片、染色中的注意事项。

制作出优质的石蜡切片的基础就是制备出合格的动物组织包埋蜡块。需要6O℃石蜡包埋制成蜡块，然后切片，切片厚度为3 ～5µm。漂片的时候为了防止切片皱褶太多，不能完全展开，可以先让切片放在35%～40%酒精上拿镊子轻轻的展开切片，待平整后再捞进摊片机摊片，摊片机水温控制在40～45℃，待切片完全展开后就可以捞片。其中包埋时需要特别注意的是肺组织由于过轻会浮于液体表面要在包埋时可等蜡在包埋模里稍冷却一下，肺组织才可固定在包埋框的下面，可以防止其漂浮起来[3]。

染色采用改良欧力式苏木素染液进行HE 染色，步骤如下：先脱蜡，二甲苯I10min、二甲苯Ⅱ5min，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅲ各片刻，流水洗2min；再染色，苏木素10min，流水洗1min，1%盐酸乙醇分化数秒，流水洗10 ～15min，0.5%伊红乙醇10 ～15s，75%乙醇、85%乙醇0.5min、95%乙醇、100%乙醇各0.5min。这个时间只能作为参考，染色时间应根据不同的组织，温度湿度具体而定。封片采用中性树胶加少量二甲苯，树胶和二甲苯的比例大概为2 ∶1，不能太稀，不然胶干了以后会有空洞。这样既可以达到透明的目的，又能避免吸入过多的二甲苯气体[4]。

综上所述，我们针对小鼠组织石蜡切片制作中遇到的问题，积极寻找原因解决问题，经过实践研究改进方法，只要前期处理好，切出的蜡片就会完整，之后无论是做HE 染色还是做免疫组化都不会出现脱片的现象，镜下可见着色均匀，细胞结构清晰，从而可正确的观察和判断组织的原始形态结构。只有把石蜡切片制作过程中每一个细节都把握精准，才能避免组织块变硬变脆，制作出高质量的小鼠各组织石蜡切片，为提高科研工作水平创造条件。