高粱自毒物质降解细菌的筛选

石 瑞，张亚琪，冯玉萍，吴 丹

（忻州师范学院 生物系，山西忻州 034000）

山西是我国高粱生产的主要省区之一，连年种植高粱，导致高粱连作障碍严重，影响高粱的可持续发展。高粱连作障碍的原因之一是根系分泌自毒物质的累积。而根系分泌的自毒物质大多是酚酸类物质（李雪利，2009），为此筛选高粱自毒物质的降解菌对解决高梁连作障碍至关重要。

目前已经筛选出了降解草莓（杜霄霞，2009）、人参（赵东岳，2013）、苹果（祁国振，2018）、花生（何志刚，2014）、番茄（何志刚，2017）、黄瓜（郭丽园，2015；孙秀，2014）等多种植物根系分泌酚酸类自毒物质的细菌、真菌或放线菌，郭丽园（2015）以外源对羟基苯甲酸为唯一碳源筛选出了黄瓜自毒物质降解菌株，细菌GLY-P3和放线菌株GLYP1、GLY-P2。 孙秀（2014）以外源肉桂酸为唯一碳源筛选出了黄瓜自毒物质降解细菌42-3和降解真菌2-4。樊芳芳等（2016）在高粱连作试验中发现，与玉米高粱轮作比较，高粱连作会降低长势和产量。吴蕾等（2009）进一步研究证实了酚酸类化合物邻苯二甲酸、没食子酸对高粱的化感作用。

目前对高粱自毒物质降解菌的筛选鲜有报道，测定降解率的方法也较单一，多用紫外分光光度法测定。所以本试验以此为出发点，以外源邻苯二甲酸及没食子酸为唯一碳源筛选高粱自毒物质降解菌株，旨在提高自毒物质降解率，为其进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 连作高粱根际土壤，晋杂16号高粱种子，福林酚试剂，邻苯二甲酸，没食子酸。初筛固体选择性培养基（孙秀，2014）：硝酸铵1 g，硫酸铵0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，邻苯二甲酸或没食子酸0.5 g，琼脂条 15 ～ 20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠 5 g，琼脂 20 g，pH 7.4 ～ 7.6，蒸馏水 1000 mL。种子发酵液培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠10 g，pH自然。降解率测定培养基：同初筛固体选择性培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g。方法：去皮的马铃薯切块儿，放入蒸馏水中煮到用玻璃棒可以戳破为止，然后用纱布过滤，再加入称好的糖和琼脂，加热融化后补水至1000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤样品的制备 取高粱重茬地根际土壤用于没食子酸、邻苯二甲酸降解细菌筛选，并于4℃冰箱中保存土壤。

1.2.2 邻苯二甲酸、没食子酸筛选浓度的确定分别制备梯度邻苯二甲酸溶液与没食子酸溶液，浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。 121 ℃灭菌 20 min，冷却后倒平板，每个浓度三个重复。将高粱种子用3%过氧化氢消毒15 min，用蒸馏水冲洗数次，于净化工作台接入不同处理培养皿，每个培养皿20粒高粱种子，28℃避光萌发数天，观察种子的生长情况。

1.2.3 降解菌的初筛

1.2.3.1 土壤悬液制备 采用稀释法处理采集的高粱根际土壤。称取高粱根际土10 g，加入装有90 mL无菌水的锥形瓶中，即制成10-1土壤悬液，于28℃富集培养30 min后充分振荡。土粒沉淀后，吸取1 mL上清液，移入装有9 mL蒸馏水的试管中，制成10-2土壤悬液，依此类推按10倍稀释法依次稀释成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8土壤悬液。

1.2.3.2 菌涂布 用75%酒精棉清洁净化工作台，将灭菌后的平板、初筛固体选择性培养基、酒精灯、火柴、封口膜等放入无菌操作台中，紫外灭菌30 min。将手进行消毒后进入净化工作台进行操作，点燃酒精灯将装有培养基的三角瓶的瓶口在酒精灯上过火灭菌，倒平板时将培养基向平板的中部倒。平板中的培养基冷却后，取10-5、10-6、10-7、10-8四个浓度的土壤悬液，每个梯度重复三个培养皿，每个培养皿100μL土壤悬液，用涂布器从中间向四周涂抹均匀，用记号笔标注清楚后过火。用封口膜密封，放入恒温培养箱30℃培养。待涂布平板长出菌落后，肉眼观察其生长情况，并将所有具有不同形态的菌在新的相应的培养基上进行平板划线分离。划线后，细菌置于37℃培养箱中培养，真菌置于28℃培养箱中培养。每24 h观察是否出现明显的单菌落，若出现特征相同的单菌落，则该分离物种为纯种并将其进行保存。若不为纯种，则可以根据单菌落的不同特征区分几种不同的微生物，分别挑取分离并保存。

1.2.4 降解菌的复筛

1.2.4.1 没食子酸标准曲线的绘制 根据王晓敏（2018）报道的方法称取没食子酸5 mg置于100 mL容量瓶中，蒸馏水溶解，摇匀定容至刻度制成50 μg/mL 的没食子酸溶液。 分别取 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL 没食子酸溶液于 50 mL 容量瓶中，各加入蒸馏水30 mL，福林酚试剂2 mL，摇匀，1 min后加入6 mL 20%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至刻度，75℃水浴10 min后冷却至室温并于760 nm处测吸光值。调零溶液除不加没食子酸对照液外，其他试剂条件都相同。将可见分光光度计开机预热20 min后，向比色皿中加入3/4的调零溶液调零，然后分别加入待测液，重复测定三次吸光值。

1.2.4.2 细菌种子培养 将初筛得到的所有细菌，每种细菌挑取三个单菌落，于净化工作台分别用接种环接种到250 mL三角瓶中 （装有种子发酵液培养基20 mL），每株一瓶，用记号笔做好标记，37℃、160 r/min恒温摇床摇瓶活化30 h左右。

1.2.4.3 调整OD值 600 nm处调整种子液OD值在1左右，用灭菌后的发酵种子培养液调整稀释。

1.2.4.4 降解率的测定 在250 mL三角瓶中装入50 mL降解率测定培养基，加1 mL细菌种子液，于37℃、160 r/min恒温摇床摇瓶培养4、8、12 h后，分别取发酵液5 mL于10 mL离心管中，4000 r/min离心10 min，取离心后的上清发酵液即降解液3 mL于10 mL试管中，添加0.4 mL福林酚试剂，1 min后加入20%碳酸钠溶液1.2 mL，于75℃恒温水浴加热10 min，待冷却至室温后，测760 nm处的吸光值。没食子酸降解液稀释5倍后测定。

降解率/%=（空白酚酸剩余量-处理酚酸剩余量）/空白酚酸剩余量。（空白：由降解率测定培养基和不加菌的发酵培养基组成；处理：由降解率测定培养基和降解菌种子液组成）。

1.2.4.5 真菌种子液制备及降解率测定 将分离得到的真菌挑取单菌落划线分离，待PDA平板上长出菌落后轻轻将菌株孢子刮起，向筛选到的邻苯二甲酸与没食子酸降解真菌的PDA平板中加入少量灭菌后的0.85%生理盐水冲洗，洗液倒入灭菌后的锥形瓶中，摇床振荡，制得单孢子悬液，控制孢子浓度为1×107cfu/mL。测降解率方法同1.2.4.4。

1.2.5 降解菌株的形态学鉴定 将降解细菌在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线分离，30℃培养；降解真菌在PDA培养基平板上三区划线，28℃培养，待长出单菌落后，观察菌落的大小、形态、颜色、透明度、边缘、表面形状及菌体的湿润度。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的绘制 由图1可知，没食子酸含量x与吸光度y的回归方程为：y=0.0665x-0.0439，R2=0.9985，线性范围为1～10μg/mL。

2.2 降解菌筛选浓度的确定结果 由图2可得出，当自毒物质浓度逐渐增高时，抑制作用也逐渐增强，发芽势逐渐降低，在浓度为0.5 g/L时抑制作用更明显，不发芽。所以选择浓度0.5 g/L为高粱自毒物质降解菌的筛选浓度。

2.3 降解菌的初筛结果 经过降解菌的初筛，初步得到两株降解没食子酸的细菌M-1、M-2以及两株降解没食子酸的真菌M-3、M-4。以邻苯二甲酸为唯一碳源的无机盐培养基筛选出三株降解邻苯二甲酸的细菌L-1、L-2、L-3以及一株降解邻苯二甲酸的真菌L-4。

2.4 降解菌的复筛结果 由图3可看出，在12 h以内降解液中自毒物质含量随着时间延长而降低，表明所筛选的M-1、M-2两种菌有降解没食子酸的能力，空白在12 h内变化不明显；菌M-1在12 h内，随着时间延长，自毒物先升后降，12 h时降解效果最显著 （P＜0.01）。菌M-2在12 h内，自毒物质随着时间延长逐渐降低，12 h时降解效果最显著（P＜0.01）。菌M-1降解率为30%，菌M-2降解率为36%。

由图4可以看出，空白和处理均在4 h时升高，4 h后经过三株菌处理后的降解液中自毒物都逐渐降低，表明筛选得到的L-1、L-2、L-3三株菌对邻苯二甲酸均具有一定的降解能力。其中菌L-2的降解效果最好，12 h时降解率为41%。菌L-3降解效果好于菌L-1。菌L-1的降解率为32%，菌L-3的降解率为33%。

2.5 降解菌形态学鉴定结果 降解真菌和降解细菌的形态学特征见表1和表2。

3 结论

本试验采用福林酚法在高梁自毒物质降解菌的筛选中取得了较好的效果，在连作多年的高粱根际土壤中筛选到了降解没食子酸的2株细菌菌株M-1、M-2以及降解邻苯二甲酸的三株细菌 L-1、L-2、L-3， 降解率分别为 30%、36%、32%、41%、33%。其中菌株M-2与L-2降解效果相对较好。

表1 降解真菌形态学特征

表2 降解细菌形态学特征