肿节风内生真菌的分离鉴定及拮抗真菌筛选

宋利沙，蒋 妮，2*，蓝祖栽，张占江

(1.广西药用植物园，广西 南宁 530023；2.广西大学农学院，广西 南宁 530004)

【研究意义】内生真菌是生活在植物健康组织和器官及生活史的某一特定时期、未对植物组织产生明显病害症状的一类真菌，种类繁多，分布广泛[1]。近年来的研究表明，从健康药用植物不同组织器官中分离到的内生真菌，通过不同培养基可筛选出很多产生抑制病原真菌活性物质的内生真菌[2-5]。肿节风为金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]的干燥全草，不但具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效[6-7]，还具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗肿瘤、促进骨折愈合及镇痛等多种活性成分，急性毒性试验结果显示无毒[8]。以肿节风为主要原料的制剂有草珊瑚含片、肿节风片、肿节风注射液和血康口服液等[9]，但迄今对肿节风内生真菌抗菌活性的研究较少。因此，分析肿节风的内生真菌多样性，筛选具有较强抗菌活性的菌株，对寻找新型抗菌和抗肿瘤活性成分原材料具有重要意义。【前人研究进展】Supaphon等[10]从3种药用海草中分离和鉴定了160种内生真菌，并研究其抗菌活性。Gupta等[11]研究发现姜黄(Curcumalonga)的内生真菌茎点霉菌(Phomaherbarum)具有拮抗叶斑病活性。Jin等[12]在人参中分离到两株具有抗菌活性且可用于发酵制备人参皂苷等成分的内生真菌[PN8(Fusariumsp.)和PN17(Aspergillussp.)]；Katoch等[13]从印度芳香植物柠檬马薄荷(Monardacitriodora)分离到28株内生真菌，分别来自11个属，其中镰刀菌(Fusarium)、黄曲霉(Aspergillusflavus)和Muscodor等具有开发为植物生物防治物质的潜力；Tanapichatsakul等[14]从传统药用植物Melodorumfruticosum的花中分离得到52株内生真菌，其中间座壳菌(Diaporthespp.)具有抗菌作用。陈娟等[15]从天山雪莲和红景天的根内分离到34株内生真菌，其中深色有隔内生真菌为优势菌群；农倩等[16]报道深色有隔内生真菌对香蕉枯萎病菌具有抑制作用；谯利军等[17]对不同地区及不同季节的健康马比木不同组织部位样本进行内生真菌多样性分析，分离出1037株内生真菌，分别隶属于30个属，其中间壳座属为优势属；元超等[18]从艾纳香分离到内生真菌间壳座属对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KCTC 1021具有非常强的抑制活性；郑瑞等[19]从蛇足石杉分离到一株无盘柄盘菌(Peziculasp.)JR14，其次生代谢产物对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性；王佳莹[20]从金钟花茎秆中分离到含有抗菌活性代谢产物的无柄盘菌属内生真菌；周丽思等[21]从药用植物丹参内生真菌中获得1株对丹参生长和丹酚酸含量具有显著促进作用活性的菌株；刘军生等[22]从七叶树(Aesculuschinensis)根和茎中分离出1株具有高产七叶皂苷C的内生真菌，其发酵液提取物具有抑菌活性；宋利沙等[23]从健康肿节风根系土壤中筛选出对肿节风炭疽病菌(Colletotrichumdematium)及14种其他植物病原真菌具有较强抑制作用的真菌。【本研究切入点】目前，对药用植物肿节风根、茎、叶中的内生真菌进行分离、鉴定并筛选出抗菌活性强内生真菌菌株的研究未见报道。【拟解决的关键问题】对肿节风根、茎、叶中的内生真菌进行分离和鉴定，并筛选出抗菌活性强的内生真菌菌株，为开发新的抗菌药物资源打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品 于2018年10-12月，在广西融安、都安、靖西和南宁等地采集肿节风健康植株的根、茎和叶，编号后封存于保鲜袋中，48 h内进行内生真菌分离。

1.1.2 供试指示菌 供试指示菌为病原真菌，共15种，分别为三七灰霉病菌(Botrytissp.)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、豆蔻叶斑病菌(Phyllostictasp.)、香蕉叶斑病菌(Alternariasp.)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、苦玄参叶斑病菌(Alternariasp.)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumsp.)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、广西莪术叶斑病菌(Phomopsissp.)、烟草灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、艾纳香褐斑病菌(Phomasp.)、肿节风炭疽病菌和罗汉果叶斑病菌Stagonosporopsiscucurbitacearum，均由广西药用植物园植物病理研究室保存提供。

1.1.3 供试培养基 供试培养基为PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 L，用于植物病原真菌培养和菌株拮抗效果测定。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌分离和纯化 采用常规组织分离法并参考Guo等[24]的方法(稍有改进)进行肿节风的根、茎和叶内生真菌分离和纯化，纯化后的菌株保藏于广西药用植物园植物病理研究室。采用超净工作台无菌检测法、漂洗液的无菌检测法和组织印迹无菌检测法检测表面消毒是否彻底，以确保肿节风内生真菌准确分离[25]。据菌落培养特征将分离、纯化的内生真菌划分为不同的形态类型[26]。

1.2.2 拮抗内生真菌筛选 采用平板对峙法[27]进行拮抗真菌筛选，在直径9 cm的PDA培养基中央接种直径5 mm的病原菌菌饼，在离菌饼2 cm的3个角点等距离接种拮抗真菌，以只接种病原菌菌饼为对照。每处理设3次重复，28 ℃恒温培养，7 d后测定菌落生长抑制率，筛选出对病原真菌有拮抗作用的内生真菌。复筛与初筛方法相同。

菌落生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-病原菌菌饼直径)×100

1.2.3 内生真菌鉴定 参考方中达的方法[28]记录菌落形态，参考魏景超的方法[29]和国际分类网站http://www.indexfungorum.org进行菌落形态初步鉴定。参考Kumar等[30]的方法，利用MEGA 7.0的邻位连接法构建ITS rDNA系统发育进化树，进行分子生物学鉴定：采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(1.25 U/50 μl)试剂盒(Takara Bio Inc.，Japan，cat. no. R076A)，挑取培养内生真菌的菌落作为模板直接用于PCR反应，用凝胶成像法检测目的条带，将有目的条带的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序；测序结果与NCBI的GenBank中的序列进行BLAST比对。

真菌种属分类地位确定：目标序列与参考序列进行BLAST比对后，同源性≥95 %的暂定为同一个属，相似性≥99 %的暂定为一个种。

1.2.4 内生真菌抗菌谱测定 参考1.2.2的方法进行抗菌谱测定，测量病原菌菌落的直径和抑制率。

2 结果与分析

2.1 肿节风内生真菌的分离和纯化结果

通过常规组织法分离，从健康肿节风的不同组织(根、茎和叶)分离到111株内生真菌纯化培养物，其中，从茎中分离到52株(即茎的分离率占46.85 %)，叶和根分别分离到38和21株。在111株内生真菌中，从广西南宁的材料分离纯化到43株(根6株、茎22株、叶15株)，从融安的材料分离纯化到18株(根4株、茎5株、叶9株)，从靖西的材料分离纯化到18株(根6株、茎4株、叶8株)，从都安的材料分离纯化到32株(根5株、茎21株、叶6株)，即从广西南宁分离纯化到的内生真菌最多，其次是都安，靖西和融安的最少。从111株内生真菌中选出不同形态类型菌株共42株进行分子鉴定。各菌株名编号、种类、分离器官及GenBank登录号等信息见表1。

表1 42株肿节风内生真菌菌株的种类信息

续表1 Continued table 1

菌株编号Strain number采样地*Collection site登录号Accession number器官Organ种类TaxonRG-4RMK429879根毛霉亚门真菌(Mucoromycotina sp. )JJ-1JMK429850茎新壳梭孢菌(Neofusicoccum parvum)DZ-8DMK429842茎柄孢壳菌属真菌(Podospora sp. )DZ-8-1DMK429843茎尖孢刺盘孢菌(Colletotrichum acutatum)DZ-10DMK429844茎哈锐刺盘孢菌(Colletotrichum horii)DZ-20DMK429845茎球座菌属真菌(Guignardia vaccinii)GJ-1GMK429867茎橡胶生拟茎点霉(Phomopsis heveicola)GJ-5GMK429868茎新壳梭孢属真菌(Neofusicoccum brasiliense)GJ-8GMK429869茎葱链格孢(Alternaria porri)GJ-8-2GMK429874茎暗色拟茎点霉(Diaporthe vaccinii)GJ-9GMK429870茎间座壳属真菌(Diaporthe pseudomangiferae)GJ-11GMK429871茎间座壳属真菌(Diaporthe eugeniae)GJ-14GMK429872茎多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)GJ-15GMK429873茎高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)RJ-1RMK429861茎橡胶生拟茎点霉(Phomopsis heveicola)RJ-2RMK429862茎橡胶生拟茎点霉(Phomopsis heveicola)RJ-3RMK429863茎拟茎点霉属真菌(Phomopsis sp. )RJ-5RMK429864茎扩散炭垫菌(Nemania diffusa)RJ-6RMK429865茎间座壳属真菌(Diaporthe hongkongensis)

注：*采样地中的D代表都安县，G代表南宁(广西药用植物园)，J代表靖西县，R代表融安县。

Note:*Collection locations，D stands for Du'an County，G stands for Nanning(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants)，J stands for Jingxi county，and R stands for Rongan county.

2.2 基于ITS序列分析内生真菌的分类地位

经PCR扩增和测序，42株不同形态类型肿节风内生真菌的ITS序列与GenBank中的41株真菌参考序列(表2)相似性在99 %以上，分属于3门9目20属28种，其中，JY-8菌株鉴定到盘菌纲水平，DY-8鉴定到目水平，DY-5鉴定到炭角菌科水平，RG-4鉴定到毛霉亚门水平，DZ-8、RJ-3、JY-3和JG-1鉴定到属水平，分别鉴定为柄孢壳菌属(Podosporasp.)、拟茎点霉属(Phomopsissp.)、多节孢属(Nodulisporiumsp.)和被孢霉属(Mortierellasp.)。

基于ITS rDNA序列构建的肿节风内生真菌系统发育进化树(图1)显示，42株内生真菌分属于10个分支，并有很高的支持率。JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4个菌株属于粪壳菌纲(Pezizomycotina)亚门黑孢菌属的种，与Nigrosporasphaerica和Nigrosporaoryzae等菌株相似率在99 %以上；JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5个菌株属于粪壳菌纲炭角菌目(Xylariales)不同属的种，JG-2鉴定为光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholtzii)，RY-3鉴定为草莓状炭团菌(Hypoxylonfragiforme)，DY-3和RJ-5鉴定为Nemaniadiffusa，其中除GG-4与Xylariaberteri相似率达99 %外，其他菌株与所对应种的相似率均达100 %；GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3个菌株属于粪壳菌纲(Glomerellales)目刺盘孢属的种，GY-13和DZ-8-1分别鉴定为Colletotrichumboninense和Colletotrichumacutatum，DZ-10鉴定为哈锐炭疽菌(Colletotrichumhorii)，相似率均达100 %；RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9个菌株属于粪壳菌纲间座壳目(Diaporthales)中的无性世代拟茎点霉属和间座壳属不同的种，RY-2、GJ-1、RJ-2和RJ-1等4个菌株鉴定为橡胶生拟茎点霉(Phomopsisheveicola)，GYB-1鉴定为Diaporthephaseolorum，RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等4个菌株分别鉴定为Diaporthevelutina、Diaporthevaccinii、Diaporthehongkongensis和Diaporthepseudomangiferae，相似率均达100 %；JG-4属于粪壳菌纲粪壳菌目(Sordariales)毛壳菌属的种，与Chaetomiumcupreum的相似性达100 %，鉴定为Chaetomiumcupreum；DZ-20、JJ-1和GJ-5等3个菌株属于座囊菌纲(Dothideomycetes)葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)球座菌属和壳梭孢属的种，与对应种GuignardiavacciniiFJ538353、NeofusicoccumparvumEU650672和NeofusicoccumbrasilienseMH809527的相似率达100 %，分别鉴定为G.vaccinii、新壳梭孢菌(N.parvum)和N.brasiliense；GJ-14、GJ-15和GJ-8等3个菌株属于座囊菌纲(Dothideomycetes)格孢腔目(Pleosporales)棒孢菌属、附球菌属和链格孢属不同的种，分别鉴定为Corynesporacassiicola、Epicoccumsorghinum和Alternariaporri；DY-6和DY-7分别鉴定为Leptosporarubella和Paraphomachrysanthemicola；JG-1属于接合菌门(Zygomycota)毛菌纲毛霉目被孢霉科被孢霉属，属于Mortierellasp.，相似率均达100 %。

表2 参与系统分析的内生真菌菌株种类、寄主、来源和登录号

注：— 表示无数据。

Note:— represented no data.

Bootstrap values was more than 50 % support from 1000 re-samplings. Gaertneriomyces semiglobiferus AY997051 was used as outgroup图1 基于ITS rDNA序列构建的肿节风内生真菌系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi of S. glabra based on ITS rDNA region sequences

从图1可看出，优势菌群RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9个菌株属于粪壳菌纲间座壳目(Diaporthales)中的无性世代拟茎点霉属(Phomopsissp.)和间座壳属(Diaporthesp.)的不同种；其次属于粪壳菌纲炭角菌目Xylariales不同属的种有JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5个菌株；属于黑孢菌属Nigrosporasp.的不同种有JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4个菌株；分属于刺盘孢属(Colletotrichumsp.)的不同种有GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3个菌株。

2.3 内生真菌的抗菌活性测定结果

以广西药用植物园植物病理研究室所保存的15种病原真菌为指示菌，采用平板对峙法对111株肿节风内生真菌进行抗菌活性测定，经初筛和复筛发现，只有RJ-1和JJ-1对15种病原真菌有较高的抗性，抑制率在60 %以上(表3)。其中RJ-1和JJ-1菌株对三七灰霉病菌、三七根腐病菌、三七炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、艾纳香褐斑病菌、苦玄参叶斑病菌和肿节风炭疽病菌等7种病原菌的抑制率均在80 %以上，具有强的抑菌广谱性。

表3 拮抗真菌的抑菌谱

注：++++：菌落生长抑制率60 %～69 %；+++++：菌落生长抑制率70 %～79 %；++++++：菌落生长抑制率>80 %。

Note:++++：Colony growth inhibition rate 60 %-69 %；+++++：Colony growth inhibition rate 70 %-79 %；++++++：Colony growth inhibition rate>80 %.

3 讨 论

本研究对广西不同地区健康肿节风不同组织的内生真菌进行分离和鉴定，得到111株内生真菌，选出其中的42个不同形态类型分属于9目20属的不同种，表明肿节风中具有丰富的内生真菌资源，与郭顺星[1]研究指出内生真菌存在于不同植物中并与宿主植物长期协同进化、互利共生的观点一致。许多内生真菌不仅从宿主植物吸取营养物质供给自身生长发育需要，而且还可提高宿主植物对环境胁迫的抗性，如抗病虫害和抗干旱性等[1]。从健康肿节风植株不同组织中分离得到的拟茎点霉属(Phomopsis)和交链孢属(Alternaria)常被认为是植物的病原真菌[31-32]，然而近年来的研究表明，此2个属所产生的次生代谢产物具有抑菌和防虫作用[32-33]，有利于协助宿主植物抵御病原菌和不良生长环境。植物内生真菌菌群在宿主植物中的组成和生态分布特征随着组织类型、季节、降水量、温度、宿主树龄、光照和营养成分等众多因素的改变而变化[31-34]，植物内生真菌与宿主间是一种动态平衡的进化过程，彼此发挥着重要的生态学功能。综上所述，内生真菌也产生具有生物活性的次生代谢产物，可为开发新的抗菌药和化合物提供重要依据。

本研究对111株内生真菌进行抑菌活性测试，获得具有较高活性、对多种病原真菌具有抑制作用的RJ-1和JJ-1菌株，分别鉴定为橡胶生拟茎点霉(Phomopsisheveicola)和新壳梭孢菌(Neofusicoccumparvum)，具有一定的潜在生防应用价值。已有研究表明，橡胶生拟茎点霉(Phomopsisheveicola)和新壳梭孢菌是橡胶幼树和柏木枯萎病的病原真菌[35-36]，而在本研究中属于内生真菌，通过回接到健康肿节风的不同组织，未出现致病现象，与Aly等[31]研究报道内生真菌寄生到健康植物上受到环境胁迫时会引起植物发病而变成病原菌、内生真菌与宿主植物呈动态平衡拮抗关系的观点不一致，有待对病原菌与内生真菌的转换关系进行探究后才能明确原因。RJ-1和JJ-1菌株的抗菌活性物质代谢产物、发酵工艺优化及其对植物生长的影响也需进行系统探讨。

4 结 论

肿节风存在丰富的内生真菌物种，从中筛选出的RJ-1和JJ-1菌株对15种病原真菌具有较强的抑制作用，可作为抗菌活性菌株开展深入研究。