基于竞争配位的Ca2+特异性响应1H/19F磁共振成像分子探针

陈洪明 唐小雪 林雅滢 龚玄清 林泓域 高锦豪

(厦门大学化学化工学院化学生物学系，谱学分析与仪器教育部重点实验室，福建省化学生物学重点实验室，厦门 361005)

0 引 言

钙离子对几乎所有细胞的信号转导都必不可少，参与从胚胎发生到神经功能的各个生命过程[1]。动物体液和组织中的总钙浓度为2.1～2.6 mmol·L-1[2]，以自由离子、有机配合物和无机物小分子3种形式存在[3]。由于自身的电荷、离子半径、可极化性等特性，Ca2+具有从6到12的灵活的配位数。特殊的配位能力使得生物体可以通过有机小分子配体和对Ca2+具有强亲和力配位位点的蛋白来调控不同形式的Ca2+在生物体内不同时空区域的浓度及比例，以发挥Ca2+信号传递作用。细胞内的游离Ca2+浓度通常可以比细胞外低4个数量级[4]。Ca2+作为信号载体参与调控细胞行使各种生理功能的过程，但其浓度平衡被打破则会产生毒性并导致细胞的死亡。脑血管疾病导致的死亡占全世界所有死亡人数的9.6%，而局域脑缺血情况的检测和监控对临床诊断和治疗脑血管疾病具有重要意义[5-6]。缺血脑区的葡萄糖氧化会被严重影响，导致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)不能正常产生，引发一系列有害的生化生理过程。例如，局域Ca2+平衡会被严重破坏而导致细胞急性或慢性死亡[7]。脑缺血时，局域的细胞外Ca2+浓度会急剧下降，临床上可以通过及时灌注来重新建立Ca2+的平衡达到治疗效果[8]。因此，Ca2+在生命体内分布的活体原位成像分析对生命科学和生物医学具有重要意义。

虽然荧光方法在细胞层面可以很好地分析检测Ca2+信息，但其有限的生物组织穿透深度严重限制了其实际应用。磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)是一种临床广泛使用的有效生物成像技术，具有软组织高分辨率，非介入，无电离辐射，不受穿透深度限制等优点。为了获得更准确的成像信息，临床上常需要造影剂辅助。虽然具有功能性响应的1H MRI造影剂被广泛研究[9-12]，其中也有一些金属离子检测的报道[13]，但人体内存在大量的水，1H MRI的背景干扰严重。19F核具有低生物背景、宽化学位移和高灵敏度等优点，因此在生物活性小分子检测方面19F MRI具有一定优势[14]。近年来，构建19F MRI探针检测生物标志物的报道也逐渐增加[15-19]。检测金属离子的19F MRI研究也有一些报道，但仍有一些问题需要克服，例如，检测Ca2+的探针存在信号单一或非阳性信号响应等问题[20-21]。另一方面，目前临床使用的1H MRI造影剂主要基于Gd3+，其毒性等问题未能完全克服[9，22]，因而基于 Mn2+的1H MRI造影剂的开发近来已引起科学家的重视[23-24]。我们把19F引入到对Ca2+有强亲和力[25]的小分子配体的结构中，利用顺磁性Mn2+对19F的偶极相互作用，即顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)效应，调控19F MRI信号，水配位数调控Mn2+对1H MRI造影效果[26]，从而通过竞争配位策略，构建了对Ca2+离子实现特异性阳性信号响应的1H/19F MRI分子探针 Mn（Ⅱ）-L(1)(图 1)。

图1 探针1对Ca2+响应的示意图Fig.1 Schematic illustration showing the response of probe 1 to Ca2+

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

AvanceⅢ500 MHz NMR谱仪(布鲁克公司，合成实验的NMR表征)；AvanceⅢ 600 MHz NMR谱仪(布鲁克公司，探针响应性质实验测试)；纽迈0.5 T NMI20 Analyst系统 (0.5 T弛豫率测试和1H MRI)；9.4 T BioSpec MRI系统 (布鲁克公司，9.4 T19F MRI)；Esquire 3000 Plus 质谱仪(布鲁克公司)；高效液相色谱系统(岛津公司，产物分离纯化)，色谱柱(Waters公司，XBridge Prep C18 5 μm OBD 19 mm×250 mm；总流速：10 mL·min-1)。 所用溶剂均为分析纯市售国药；反应试剂购买于伊诺凯、百灵威、阿拉丁和阿尔法公司，纯度均不低于97%。

1.2 化合物的合成及表征

探针Mn（Ⅱ）-L(1)合成路线示意图如图2所示。

化合物3的合成：在圆底烧瓶中将2，2，2-三氟乙胺(2.5 g，25 mmol)溶解于 60 mL CHCl3，加入 20 mL K2CO3水溶液(5.2 g，38 mmol)，反口塞密封并插N2气球，用低温反应釜将溶液冷却到5℃。在搅拌下把20 mL溴乙酰溴的CHCl3溶液(7.5 g，38 mmol)于30 min内滴加到上述两相溶液中，把反应体系转移到室温继续搅拌15 h。除去水相，有机相用饱和NaHCO3水溶液洗1次，再用纯水洗3次，无水Na2SO4干燥后旋蒸得白色固体产品3(2.4 g，87%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 4.00～3.90(m，4H)，6.83(1H，NH)；19F NMR(470 M，CDCl3)：δ-72.41(s)。

化合物 4 的合成：将 2，2′-(亚乙基二氧)双(乙胺)(0.75 g，5 mmol)溶解于30 mL甲醇，室温下滴加入苯甲醛(1.3 g，12 mmol)后，于65℃搅拌回流5 h。冷却到室温后分多次加入NaBH4(1.5 g，40 mmol)，继续搅拌5 h后旋蒸除去溶剂。用二氯甲烷(dichloromethane，DCM)溶解，水洗3次，旋蒸除去溶剂。DCM和MeOH(体积比为 100∶1～100∶7)过硅胶柱纯化得浅黄色油状液体产品4(1.8 g，82%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 7.20～7.34(m，10H，Ar-H)，3.74(s，4H，Ar-CH2)，3.56～3.60(m，8H，CH2OCH2)，2.73(t，J=5 Hz，4H，NCH2)；ESI-MS(m/z)C20H28N2O2理论值(M+H)+328.2，测得 329.6。

化合物5的合成：在圆底烧瓶中将4(1.0 g，3 mmol)溶解于 40 mL DCM，加入N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine，DIPEA)(1.3 g，10 mmol)，反口塞密封并插N2气球，用低温反应釜将溶液冷却到-20℃。在搅拌下把10 mL溴乙酸叔丁酯的DCM溶液(1.28 g，6.6 mmol)于1 h内滴加到反应液中，把反应体系转移到室温继续搅拌20 h。水洗3次后旋蒸除去溶剂。MeOH和DCM(体积比值为0～1/100)过硅胶柱纯化得无色油状液体产品5(1.3 g，78%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 7.18～7.35(m，10H，Ar-H)，3.79(s，4H，Ar-CH2)，3.58(t，J=5.5 Hz，4H，CH2O)，3.55(s，4H，OCH2CH2O)，3.27(s，4H，CH2COO)，2.85(t，J=6.0 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；ESI-MS(m/z)C32H48N2O6理论值(M+H)+557.4，测得 557.5。

图2 探针1合成路线示意图Fig.2 Schematic illustration showing the synthesis of probe 1

化合物6的合成：将5(1.12 g，2 mmol)和甲酸铵(0.63 g，10 mmol)溶于60 mL甲醇，加入10%的钯碳(1.0 g)后于65℃搅拌回流5 h。冷却到室温后用硅藻土过滤，滤液旋蒸除去溶剂后用DCM溶解并水洗3次，无水Na2SO4干燥后旋蒸得油状液体产品6(0.65 g，86%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 3.61(s，4H，OCH2CH2O)，3.58(t，J=6.5 Hz，4H，CH2O)，3.31(s，4H，CH2COO)，2.78(t，J=6.5 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；ESI-MS(m/z)：C18H36N2O6理论值(M+H)+377.3，测得377.7。

化合物7的合成：在圆底烧瓶中将6(0.65 g，2 mmol)和 DIPEA(1.2 g，4 mmol)溶于 60 mL DCM。 反口塞密封并插N2气球，冷却到-20℃，滴加入10 mL 3(1.1 g，2.4 mmol)的DCM溶液，反应体系转移到室温继续搅拌16 h。旋蒸除溶剂后用DCM溶解，再水洗3次，有机相用无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂，过硅胶柱纯化得白色固体产品7(0.82 g，73%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 3.87～3.94(m，4H，CF3CH2)，3.56(s，4H，OCH2CH2O)，3.51(t，J=5.0 Hz，4H，CH2O)，3.39(s，4H，CH2COO)，3.35(s，4H，CH2COO)，2.87(t，J=5 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；19F NMR(470 MHz，CDCl3)：δ-72.28；ESI-MS(m/z)C26H45F6N4O8理论值(M+H)+655.3，测得655.3。

化合物8的合成：将 7(0.65 g，1 mmol)溶于 10 mL乙酸，加入10 mL 36%(w/w)浓盐酸，室温搅拌10 h后旋蒸除去溶剂。以水/乙腈为淋洗剂过高效液相色谱(HPLC)纯化得白色固体产品 8(0.45 g，82%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 3.93～3.98(m，4H，CF3CH2)，3.65(t，J=5.0 Hz，4H，CH2O)，3.63(s，4H，OCH2CH2O)，3.60(s，8H，OOCCH2CH2COO)，3.05(t，J=5 Hz，4H，NCH2)；19F NMR (470 MHz，CDCl3)：δ-73.73；ESI-MS(m/z)C18H28F6N4O8理论值(M+H)+543.2，测得 543.3。

探针 1的合成：将 8(0.2 g，0.37 mmol)溶于 20 mL水中，用1 mmol·L-1NaOH溶液把pH值调到7.5。 加入MnCl2·4H2O(88 mg，0.45 mmol)， 用稀NaOH溶液(0.1 mmol·L-1)缓慢调节pH值到7，搅拌30 min后过HPLC纯化(水/甲醇为淋洗剂)，冻干得白色固体产品 1(0.17 g，76%)：19F NMR(564 MHz，D2O)：δ-67.2(严重展宽)；ESI-MS(m/z)C18H26F6MnN4O8理论值(M+H)+595.4，测得596.0。

1.3 探针对Ca2+响应的T2性质测试

相同浓度的探针1(1 mmol·L-1)分别与不同浓度CaCl2在Tris缓冲液(pH=7.4)中进行反应，在反应不同时间点分别测其1H的T2值(0.5 T)。

1.4 探针对Ca2+响应的19F NMR和1H MRI性质测试

相同浓度探针1(1 mmol·L-1)分别与不同浓度CaCl2在Tris缓冲液(pH=7.4)中进行反应，反应时间均为30 min，反应后分别测其19F NMR(14.1 T，564 MHz)谱和1H MRI(0.5 T)。

1.5 探针响应前后弛豫率r1的变化及1H MRI测试

探针 1(1 mmol·L-1)及其与 CaCl2(5 mmol·L-1)在Tris缓冲液(pH=7.4)中反应后分别逐级稀释后测1H的T1值及 MRI(0.5 T)；不同浓度的探针与5 mmol·L-1探针反应后测1H MRI(0.5 T)。

1.6 探针选择性测试

探针1(1 mmol·L-1)与不同金属离子在Tris缓冲液 (pH=7.4)中反应30 min后分别测反应液的19F NMR 谱(14.1 T，564 MHz)和1H 的 T1值(0.5 T)。

1.7 探针对Ca2+响应的19F MRI性质测试

探针 1(5 mmol·L-1)与不同浓度 CaCl2在 Tris缓冲液中反应后在进行19F MRI测试(9.4 T)。

1.8 探针对血清和血浆中Ca2+响应的19F NMR测试

向用生理盐水稀释10倍的小鼠血清和血浆中加入探针 1(终浓度为 0.1 mmol·L-1)和 10%(V/V)的D2O，反应后进行19F NMR测试(14.1 T，564 MHz)。

2 结果与讨论

2.1 探针1对Ca2+响应的1H的T2性质测试

相同浓度探针1分别与不同浓度Ca2+反应，其反应液1H的T2均1 min达到恒定值，表明Ca2+对Mn2+的取代反应都很快就能完成(图S1)。其中，T2是指横向弛豫时间，是施加90°脉冲后横向磁化矢量衰减到37%所需要的时间。同时，反应后的T2随Ca2+浓度的增加而变短 (图3a)，表明有更多Mn2+被Ca2+从配体上取代而变为游离态。当Ca2+浓度达到探针的10倍时，T2不再随Ca2+浓度增加而变化，表明此时Mn2+基本都被取代而变为游离态。因此，通过1H的T2值表征可知，Ca2+对Mn2+的取代反应动力学很快，探针能实现快速响应，且Ca2+浓度为探针5倍时，大部分探针已经反应完成。ESI-MS表征的分子量在与Ca2+反应后从596.0变为581.0，进一步确认了探针中的Mn2+被Ca2+所取代(图S2)。

图3 通过(a)1H的T2变化和(b)19F NMR表征1 mmol·L-1探针1对不同浓度Ca2+的响应;(c)为(b)相应的信噪比曲线(对应-72.1的峰)Fig.3 Response of probe 1(1 mmol·L-1)to Ca2+with different concentrations based on(a)T2of1H and(b)19F NMR;(c)Corresponding SNRs of the peak at-72.1 in(b)

2.2 探针1对Ca2+响应的19F NMR性质测试

通过前面的T2性质表征得到了探针1对Ca2+响应的时间和浓度参数，我们进一步测试了其19F NMR信号的响应情况。如图1和图3(b，c)所示，探针1的19F NNR谱图中，由于顺磁性Mn2+的近距离顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)作用导致19F核的T2从680 ms急剧缩短到1 ms以下，从而引起谱峰严重展宽。当加入Ca2+后，在-72.1位置出现了尖锐的谱峰，且谱峰的信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)随着 Ca2+浓度的增加而增加，其变化趋势与T2性质一致。因此，该探针对Ca2+具有很好的19F NMR信号响应。

2.3 探针1响应前后弛豫率r1的变化及1H MRI测试

根据 Solomon-Bloembergen-Morgan(SBM)理论[26]，当探针中的Mn2+被Ca2+取代后变为游离态时，Mn2+的水配位数变大，其对水中1H的纵向弛豫率r1也会变大。为了获得探针1在响应前后其r1变化的定量结果，我们分别测试了0.5 T场强下探针自身及探针(1 mmol·L-1)与 Ca2+(5 mmol·L-1)反应后的 r1值(如图 4a)。 结果显示，探针的 r1为 2.68 mmol·L-1·s-1，与5倍物质的量的Ca2+反应后，其r1变为 6.26 mmol·L-1·s-1，增加了 1 倍多。图 4b 所示为不同浓度的探针与5 mmol·L-1的Ca2+反应前后的T1权重1H MRI。其中，T1是指纵向弛豫时间，是施加90°脉冲后纵向磁化矢量恢复到63%所需要的时间。结果也显示探针与Ca2+反应后，其信号都有不同程度的变亮，表明探针响应后，其r1变大。因此，该探针对Ca2+具有很好的1H MRI信号响应。

图4 探针响应前后的弛豫率(a)r1及(b)1H MRI表征Fig.4 (a)r1 and(b)1H MRI of probe 1 before and after responding to Ca2+

2.4 探针1选择性测试

选择性是一个探针的重要性质，所以我们在研究了响应性质后进一步对探针1选择性进行研究。如图5(a，b)所示，我们通过19F NMR信号和1H的T1两个参数的测试研究了体内存在的Na+、K+、Mg2+、Zn2+几种金属离子对探针检测Ca2+的干扰。结果显示，探针1对Ca2+的响应具有很好的选择性。

图5 利用(a)19F NMR和(b)1H的T1表征探针1(1 mmol·L-1)的选择性Fig.5 Selectivity of probe 1(1 mmol·L-1)characterized by(a)19F NMR and(b)T1 of1H

2.5 探针1对Ca2+响应的1H MRI(0.5 T)和19F MRI(9.4 T)性质测试

我们进一步研究了0.5 T下1 mmol·L-1探针1与不同浓度Ca2+响应后T1权重的1H MRI(图6a)。结果显示，随着Ca2+浓度的增加，1H MRI信号逐渐变亮，表明Mn2+变为游离态后，其r1变大。该实验结果与之前r1测试结果一致。而19F MRI的结果则如图6b所示，由于19F与探针中顺磁性Mn2+的距离很近，强烈的PRE作用使得19F的T2急剧缩短，探针本身的19F MRI信号基本测不到。随着Ca2+浓度的增加，在化学位移-72.1处的19F MRI信号逐渐变亮，与19F NMR信号变化(图3)一致，表明该探针对Ca2+具有很好的19F MRI信号响应。

图6 探针1对不同浓度Ca2+响应的1H/19F MRI测试:(a)1 mmol·L-1探针 1与不同浓度 Ca2+反应的1H MRI表征(0.5 T);(b)5 mmol·L-1探针 1 与不同浓度Ca2+反应的19F MRI(9.4 T)表征Fig.6 (a)1H MRI(0.5 T)of 1 mmol·L-1probe 1 and(b)19F MRI(9.4 T)of 5 mmol·L-1probe 1 in response to Ca2+with different concentrations

2.6 探针对血清和血浆中Ca2+响应的19F NMR测试

基于以上对探针性质的研究，我们初步研究了探针对鼠血清和血浆中Ca2+响应情况。如图7所示，探针分别与血清和血浆作用后，化学位移-72.1处的19F NMR信号都得到显著恢复。因此，该探针对血液中的Ca2+具有很好的19F NMR信号响应。

图7 0.1 mmol·L-1探针1对稀释10倍的小鼠血浆和血清响应的19F NMR表征Fig.7 Response of 0.1 mmol·L-1probe 1 to the blood plasma and serum(diluted by 10 folds)of mice characterized by19F NMR

3 结 论

含19F的小分子配合物探针Mn（Ⅱ）-L(1)中的顺磁性Mn2+能通过PRE效应强烈缩短19F弛豫时间T2，从而有效降低19F磁共振信号。生理pH值条件下，Ca2+能通过竞争配位特异性地与探针1快速反应，将Mn2+从探针中取代下来。Mn2+被取代后变为游离Mn2+而远离19F，19F弛豫时间恢复变长，其磁共振信号(NMR/MRI)得到恢复。同时，Mn2+由配合态变为游离态，其水配位数增加，对水的1H弛豫率r1显著变大，从而在探针对Ca2+响应后1H MRI信号显著变化。因此，Mn（Ⅱ）-L能通过19F NMR/MRI和1H MRI多重信号变化同时实现对Ca2+的特异性检测。探针1对血浆和血清中Ca2+的成功响应，显示出该探针在活体19F MRI检测Ca2+中的良好潜力。

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