白细胞介素-21与复发性鼻息肉组织中IgE的相关性分析

杜 崑 郑 铭 王向东 张 罗

(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730)

在西方国家，85%的鼻息肉患者表现为以2型免疫为主的嗜酸性炎性反应并伴有组织内总IgE的升高[1]，高IgE表达的强2型免疫反应也与疾病术后的复发密切相关[2]。目前针对IgE的单克隆抗体被证实可有效治疗鼻息肉[3]，这表明息肉组织内增多的IgE可能参与了鼻息肉的致病过程。亚洲人鼻息肉的免疫特点与西方国家存在显著差异[4]，近年来2型免疫反应在中国患者的鼻息肉局部呈逐年增加的趋势[5]。

从外周血循环迁移到息肉组织内的初始B细胞，在抗原刺激下，经Tfh细胞辅助增生形成生发中心，进而发育为成熟的IgE型浆细胞并参与免疫过程。在生发中心反应中，源于Tfh细胞的CD40分子配体(CD40 ligand, CD40L)、白细胞介素(interleukin，IL)-21和IL-4参与到了T-B细胞之间的信号传递并促进IgE型B细胞分化成熟[6]。IgE在复发的慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)患者中表达增高[2, 7]，但是作为在生发中心反应中IgE合成的关键分子，CD40L和IL-21对鼻息肉复发的影响仍不清楚，它们对易复发和不易复发的鼻息肉患者的IgE产生是否发挥着不同的作用仍不清楚。

本研究旨在探讨IL-4、CD40L和IL-21对疾病复发的影响,并进一步分析CD40L和IL-21在术后3年时间内的复发和未复发性鼻息肉患者中对 IgE产生的影响，为进一步的临床生物治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2011年1月至2012年12月就诊于首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科并行鼻内镜下鼻窦开放和鼻息肉切除手术的CRSwNP患者73例和无鼻腔鼻窦疾病的健康受试者24例，CRSwNP患者中男性53例(72.6%)，女性20例(27.4%)，平均年龄为(45.03±13.53)岁；健康受试者中男性18例(75%)，女性6例(25%)，平均年龄为(40.83±13.20)岁。所有患者CRSwNP的诊断符合2012年EPOS指南的诊断标准[8]。入组标准：年龄>16岁的双侧CRSwNP患者，且术前4周内未使用鼻喷和口服糖皮质激素治疗和无急性上呼吸道感染者。排除标准:年龄不满16周岁，合并有免疫缺陷、囊性纤维化、真菌性鼻窦炎和单侧鼻窦炎患者。根据随访时间内疾病是否复发进行分组(复发组33例，未复发组40例)。本研究方案经由首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会审核通过(批号：TREC2011-21)，参与研究的受试患者均签署知情同意书。

入组的CRSwNP患者术前记录性别、年龄、哮喘病史和吸烟史等临床资料。行皮肤点刺试验记录患者是否伴有变应性因素，待测吸入过敏原包括：树木组合(柳树/杨树/榆树)、普通豚草、艾蒿、室内尘螨组合(屋尘螨/粉尘螨)、屋尘、猫、狗、蟑螂和霉菌。采集外周血并记录嗜酸性粒细胞百分比，术后给予规范药物治疗2～3个月，药物治疗方案包括规律使用鼻喷糖皮质激素、黏液促排剂和0.9%(质量分数)氯化钠注射液鼻冲洗。对所有患者门诊随访3年以上，息肉复发的诊断标准[9]：经鼻内镜检查发现带蒂息肉样新生物形成，鼻塞、流涕、头痛和嗅觉减退症状中伴有2项或2项以上，再次给予常规药物治疗3个月后症状无法改善者。

1.2 免疫学检测

手术中获取受试者的鼻息肉样本后冻存于-80 ℃ 冰箱，待受试者完成随访后取出并制备组织匀浆，制备方法参照文献[10]。即获取冰冻组织100 mg，在含有少量液氮的培养皿中约切成2 mm×2 mm，之后将组织连同磁珠置入匀浆仪(德国B.Braun-Melsungen公司)高速匀浆处理15 min，加入含有1%蛋白酶抑制剂(美国Sigma Aldrich 公司)的0.9%(质量分数)氯化钠注射液并离心3 000 r/min,10 min，4 ℃，收集离心后上清液冻存于-80 ℃待检测时取出。

通过Luminex检测试剂盒(美国R&D Systems公司)，通过Bio-Plex 200(美国BioRad公司)检测冻存的上清液中IL-4、IL-21和CD40L；使用ImmunoCAP(瑞典Phadia公司)检测总IgE浓度。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，经Kolmogorov-Smirnov检验验证数据的正态性分布，符合正态分布的定量资料使用独立样本t检验对比组间差异和Pearson相关性检验分析变量之间的相关性；不符合正态分布的定量资料使用Mann-WhitneyU检验对比组间差异和Sperman相关性检验分析变量之间的相关性。对于定性临床资料采用χ2检验对比组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征分析

73例CRSwNP患者和24例无鼻腔鼻窦疾病的健康受试者的人口学特征和临床特征见表1。两组患者年龄和性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，外周血Eos计数、吸烟者和哮喘者比例以及组织总IgE浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 复发和未复发CRSwNP患者的免疫学特征分析

73例患者均接受了功能性鼻内镜手术治疗，手术方式包括筛窦/上颌窦开放术、额窦/筛窦/上颌窦开放术、蝶窦/筛窦/上颌窦开放术和全组鼻窦开放术，两组患者接受的手术方式比较，差异无统计学意义(P>0.05)。复发组患者的组织总IgE和患有哮喘病史患者的比例显著高于未复发组，差异有统计学意义(P<0.05)；复发组患者外周血Eos百分比虽然明显高于未复发组，但差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者间息肉组织内的IL-21、CD40L和IL-4比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

2.3 CRSwNP复发相关的Logistic回归分析

以术后门诊随访3年后CRSwNP患者的复发与否为因变量，以鼻息肉组织匀浆中的总IgE、IL-21、IL-4和CD40L为自变量进行二元Logistic回归分析。经回归分析后证实局部鼻息肉组织内高表达的IgE是术后复发的危险因素，而IL-4、CD40L和IL-21与疾病的复发无明显相关性(表3)。

表1 CRSwNP患者和健康受试者的临床特征

CharacteristicsControl (n=24)CRSwNP (n=73)PGender (male/female)18/653/200.818Age/a40.83±13.2045.03±13.530.186Blood eosinophils/%1.60 (1.40-3.00)5.20 (2.95-8.40)<0.001Asthma0 (0)14 (19.18)0.018Smoker3 (12.5)32 (43.84)0.006Recurrence (recurrence/non-recurrence)-33/40-Tissue total IgE/(KU·L-1)1.04 (0-3.52)150.70 (67.76-407.28)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

表2 复发和未复发CRSwNP患者的临床特征与免疫学特征

CharacteristicsNon-recurrence (n=40)Recurrence (n=33)PGender (male/female)32/828/50.590Age/a44.53±14.9545.65±11.670.723Blood eosinophils/%4.40 (2.50-7.20)5.95 (3.7-9.45)0.070Asthma4 (10)10 (30.3)0.028Skin prick test positive13 (32.5)9 (27.3)0.628Smoker18 (45.0)14 (42.42)0.825Surgical proceduresBilateral patency of ethmoidal and maxillary sinus5 (12.5)1 (3.0)0.212Bilateral patency of frontal, ethmoidal and maxillary si-nus5 (12.5)4 (12.1)1.000Bilateral patency of sphenoid, ethmoidal and maxillary sinus4 (10.0)4 (12.1)1.000Bilateral patency of all four sinus26 (65.0)24 (72.7)0.479IL-4/(pg·mL-1)3.14 (3.14-74.14)3.14 (3.14-74.14)0.802IL-21/(ng·mL-1)1.72±0.741.82±1.210.694CD40L/(pg·mL-1)320.21 (167.09-552.31)304.09 (167.20-776.05)0.825Tissue total IgE/(KU·L-1)98.89 (43.56-255.20)257.40 (143.00-776.05)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps；IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

表3 CRSwNP术后复发相关生物学指标的二元Logistic回归分析结果

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps;IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

2.4 IL-21与易复发的CRSwNP组织中IgE的相关性

由于组织总IgE在复发组与未复发组比较，差异有统计学意义，且Logistic回归分析表明鼻息肉局部增多的IgE是复发的危险因素，故而进一步分析与IgE差异表达相关的免疫分子。在73例患者中，组织总IgE与IL-21水平呈正相关(r=0.290，P=0.01)(图1A)，与CD40L、IL-4无相关性；CD40L与IL-21呈正相关(r=0.440，P<0.001)(图1B)。根据疾病的复发与否对患者进行分组发现，在复发组中，IgE与IL-4和CD40L无明显相关，与IL-21呈显著相关(r=0.374，P=0.029)(图1C, D)；未复发组中IgE与IL-4、CD40L和IL-21均无相关性。

图1 免疫学分子相关性分析

3 讨论

CRSwNP是一种高度异质性疾病，根据其局部组织的病理和免疫学特征不同又可分为不同的内在型，不同内型疾病对药物的敏感性和手术治疗的效果也不同[11]。对于严重的2型免疫反应介导的CRSwNP术后复发概率更大，为患者的生活质量带来了极大的困扰，也极大地增加了社会和个人的医疗负担。IgE是2型免疫反应中的关键分子，与哮喘的合并发生和术后疾病的复发有着密切关系[12]。虽然目前使用IgE单克隆抗体对其进行靶向治疗可以有效改善疾病严重程度，但是其临床应用也存在一定限制，如临床不良反应和昂贵的价格等，故而深入研究参与疾病复发的IgE相关的免疫分子可以为后续的生物治疗提供可靠的理论依据。

本研究结果显示，复发的CRSwNP其局部组织内有着更高浓度的IgE，并且合并有哮喘病史的比例更高，这与既往研究[13]的相关结果是一致的。另外本研究中外周血中Eos在复发组中的含量明显高于未复发组，但差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是与数据的离散分布和样本量较小有关。经过Logistic回归分析发现组织局部增多的IgE是CRSwNP复发的危险因素，而IL-4、CD40L和IL-21与疾病的复发无明显相关。同样，虽然复发组与未复发组IL-4、CD40L和IL-21组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但是在复发组中，组织内IgE的含量与IL-21是呈正相关。这表明CD40L、IL-4和IL-21并没有直接参与疾病的复发，但是IgE作为2型免疫反应的关键分子与疾病的复发相关，而IL-21可能协助参与了复发组鼻息肉组织中IgE的合成。

IgE在息肉组织中的合成有赖于IgE分泌型的浆细胞的存在。在骨髓中发育成熟的初始B细胞经外周血到达二级淋巴器官(如脾脏和淋巴结)和黏膜淋巴组织中。近年来有研究[14-15]证实，鼻息肉组织内淋巴细胞丰富，可能成为一种异位淋巴组织,并且最近有多项研究在息肉组织内发现了生发中心样结构，这表明息肉组织内存在B细胞的发育成熟和浆细胞的分化形成。在经典的生发中心反应过程中，滤泡辅助T细胞(follicular helper T)通过其胞膜表面的CD40L和T细胞抗原识别受体(T-cell antigen receptor,TCR)与分别B细胞膜上的CD40分子和MHC II类分子结合完成细胞间的相互作用，促进B细胞的发育成熟[16]。IgM型初始B细胞在这个反应过程中根据Tfh细胞所释放的信号不同而分化发育为不同类型的浆细胞(如IgG型、IgA型和IgE型)，在IL-21和IL-4的作用下可以诱导初始B细胞发生类别转化进而分化发育为IgE型浆细胞[17]。故而，CD40L、IL-4和IL-21都是参与最终IgE产生的关键分子。在本研究中CD40L与IL-21有显著相关性，这与IL-21和CD40L在生发中心反应中的协同作用是一致的。在未复发的CRSwNP患者中，IgE与CD40L、IL-21和IL-4均无相关性，然而在复发的CRSwNP患者中IgE与IL-21呈显著正相关。这表明在术后3年里易复发和不易复发的CRSwNP其IgE的产生机制可能是不同的。基于IgE产生的免疫学分子机制和本研究的结果，笔者推测在未复发的患者中，其IgE的产生可能更多是来源于外周血迁移而来的浆细胞而非在局部接受抗原提呈后直接发生了分化成熟；在复发的患者中，其IgE的产生与源于局部的分化发育成熟有关，这需要在未来的研究中进一步从分子和细胞层面去证实。

CRSwNP的本质是一种鼻腔鼻窦黏膜的慢性炎性增生性疾病，虽然目前对于经过药物治疗3个月以上无效的患者需要采用鼻内镜手术干预来缓解鼻腔症状，这并不能从发病原因上遏制其发病，故而随着随访时间的延长，越来越多的患者出现了疾病的复发。在Calus等[18]的一项长达12年的回顾性研究中发现，80%的CRSwNP患者出现了疾病的复发现象，其中有37%的患者需要再次接受手术治疗以达到缓解症状的目的。故而深入的研究其发病和复发的分子机制，找到更多可靠的靶向治疗分子，提高生物治疗的临床选择和应用范围，以逐步实现对疾病治愈的临床目的。本研究证实了在中国人群中，CRSwNP患者相比健康人群而言，其鼻腔组织内的IgE含量是增多的，并且增多的IgE与疾病的复发是相关的。之后，从与IgE合成相关的免疫分子中筛选到CD40L、IL-4和IL-21，对其进行相关性分析发现IL-21可能参与到了复发病例中IgE的合成。本研究的不足之处在于未能从细胞层面对其进一步佐证，这需要在接下来的研究中不断完善。尽管如此，本研究证实了IL-21而不是CD40L与复发的CRSwNP中IgE的合成的关系，为将来的生物靶向治疗提供理论参考依据。