乳腺癌组织剪切波弹性成像弹性模量值及其与病理特征、增殖和侵袭基因蛋白表达的相关性▲

褚 鑫 安晓夏 严剑波 张红梅

(山东省秦皇岛市妇幼保健院1 功能科，2 超声科，秦皇岛市 066000，电子邮箱：chdejuan@126.com)

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率也位居女性恶性肿瘤前列[1-2]，早期诊断疾病并判断其病理特征有助于准确认识疾病、制定治疗方案。剪切波弹性成像(shear wave elastography，SWE)是近年来发展起来的超声检查手段，其在质地硬的组织中传播速度快，而在软的组织中传播速度慢，所以可以根据超声波在不同弹性组织中传播速度的差异来反映组织弹性。在恶性肿瘤发生发展的过程中，病灶内癌细胞的增殖和侵袭会引起局部组织硬度增加，因此，通过SWE来检测病灶组织的硬度可以判断病灶恶性特征，甲状腺癌组织的SWE参数发生显著变化并且与多种癌基因的表达相关[3]。为了明确SWE在乳腺癌病情评价中的作用价值，本研究分析乳腺癌SWE弹性模量与病灶内增殖、侵袭基因蛋白表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2016年3月至2018年3月期间在我院接受手术切除的42例乳腺癌患者及30例乳腺良性肿瘤患者，纳入标准：(1)经术后病理明确诊断为乳腺癌或乳腺良性肿瘤；(2)术前均接受SWE检查；(3)取得患者知情同意。排除标准：(1)术前接受过放化疗、靶向药物治疗者；(2)临床资料不完整者。乳腺癌患者年龄43～64(53.31±7.62)岁，已绝经17例；乳腺良性肿瘤患者年龄37～60(52.18±8.41)岁，已绝经9例。乳腺癌患者和乳腺良性肿瘤患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂与仪器 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液(货号：P0013)及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量检测试剂盒(货号：P0012)购自上海碧云天公司，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9单克隆抗体购自Santa Cruz公司(货号：SC-8396、SC-6246、SC-53906、SC-13595、SC-393859)，二抗购自北京全式金公司(批号：HS201-01)。HD5型超声诊断仪购自飞利浦公司，Tanon4800型凝胶成像仪购自上海天能公司。

1.3 SWE检查方法 首先进行常规超声，记录病灶的位置、大小、形态、边界、血流等信息。随后进行SWE检查，探头频率调至5～14 MHz、检查区域调至病灶面积的2倍，静置3～5 s后图像稳定并冻结，测定病灶的弹性模量值，每个病灶重复测量3次，计算平均值。

1.4 增殖、侵袭基因蛋白表达检测方法 取患者手术切除的肿瘤组织，采用RIPA蛋白裂解液提取乳腺癌和乳腺良性肿瘤组织蛋白，BCA试剂盒检测蛋白含量后，取50 μg蛋白样本与上样缓冲液混合，加热变性后加入聚丙烯酰胺凝胶的点样槽内，电泳、电转膜后将蛋白样本从凝胶转移至硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜放入5%脱脂牛奶，室温封闭2 h，用TBST溶液洗膜3次，5 min/次，加入1 ∶1 000稀释的一抗CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、β-肌动蛋白(内参蛋白)，4℃孵育过夜；用TBST溶液洗膜3次，5 min/次，加入1 ∶2 000稀释的二抗，室温孵育2 h。在凝胶成像仪中曝光硝酸纤维素膜，观察蛋白条带，采用Image J软件扫描条带灰度值，将目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值为目的蛋白的表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌和乳腺良性肿瘤组织SWE图像与弹性模量值的比较 乳腺癌和乳腺良性肿瘤的SWE图像见图1，乳腺癌、乳腺良性肿瘤SWE的弹性模量值分别为(83.51±11.32)、(32.77±6.03)。乳腺癌的弹性模量值高于乳腺良性肿瘤(t=22.360，P<0.001)。

乳腺癌 乳腺良性肿瘤

图1 乳腺癌和乳腺良性肿瘤的SWE图像

2.2 不同病理特征患者乳腺癌组织SWE参数的比较 不同肿瘤象限、病理分型患者的乳腺癌组织弹性模量值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤直径T3者的弹性模量值高于T1～2者，伴淋巴结转移者的弹性模量值高于不伴淋巴结转移者，临床分期Ⅲ期者的弹性模量值高于Ⅰ～Ⅱ期者(均P<0.05)。见表1。

表1 不同病理特征患者乳腺癌SWE参数弹性模量值的比较(x±s)

2.3 乳腺癌和乳腺良性肿瘤组织中增殖侵袭基因蛋白表达水平的比较 乳腺癌组织CyclinD1、MMP-2、MMP-9的相对表达水平高于乳腺良性肿瘤组织；p21的相对表达水平低于乳腺良性肿瘤(均P<0.05)；两种组织p27的相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 乳腺癌组织SWE参数与增殖侵袭基因表达水平的相关性 选择2.3中差异有统计学意义的增殖侵袭基因CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平与乳腺癌组织SWE弹性模量值进行相关性分析，结果显示乳腺癌组织SWE弹性模量值与CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平呈正相关，与p21蛋白表达水平呈负相关(均P<0.05)。见表3。

表2 乳腺癌和乳腺良性肿瘤组织CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较(x±s)

表3 乳腺癌组织SWE弹性模量值与增殖侵袭基因蛋白表达水平的相关性

3 讨 论

多普勒超声是临床上筛查乳腺肿瘤、甲状腺肿瘤的常用手段，具有无创、无辐射、可重复性好的优点，通过获取肿瘤的形态、边界、血供、钙化等信息评估肿瘤的性质。SWE的原理是通过超声探头发生声辐射力并在组织中形成横向传播的剪切波，剪切波在不同弹性的组织中传播速度存在显著差异[4-5]，可通过SWE参数弹性模量值的测定评估病灶组织的弹性，从而判断病灶性质[6-7]。

有研究显示，SWE对甲状腺癌及乳腺癌具有一定的诊断价值[8-9]；唐智勇等[10]的研究则证实SWE对乳腺癌化疗的效果具有一定的评估价值。乳腺癌病灶弹性的改变与病灶内癌细胞的增殖及浸润密切相关，癌细胞自身的增殖会使局部组织的硬度增加，而癌细胞的浸润则会使周围组织受牵拉并引起硬度增加[9]。本研究结果显示，乳腺癌组织的弹性模量值高于乳腺良性肿瘤组织(P<0.05)，提示乳腺癌病灶组织的弹性明显下降、硬度明显增加，SWE对乳腺癌具有一定的评估价值。肿瘤的部位、大小、分型、分期、淋巴结转移等病理特征被用于反映乳腺癌病灶的增殖和浸润情况，本研究结果显示，病灶直径越大、临床分期越高及发生淋巴结转移者SWE弹性模量值增加，这提示弹性模量值与乳腺癌病理特征密切关系，因此通过SWE检查或可以对病理特征进行评估。

目前已知与乳腺癌病灶内癌细胞增殖、浸润相关的基因有CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9等。CyclinD1、p21、p27参与细胞周期调控，CyclinD1与相应激酶结合后能够缩短细胞周期时限、加速细胞周期转化并使大量细胞进入有丝分裂阶段、促进细胞增殖[11-12]；p21、p27能够拮抗CyclinD1与激酶的结合并阻碍细胞周期进入有丝分裂阶段、抑制细胞增殖[13]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中的明胶酶，在肿瘤病灶内能够水解细胞外基质及基底膜中的多种蛋白成分，进而促进肿瘤细胞离开原发病灶、向邻近及远处浸润[14-15]。本研究结果显示，乳腺癌组织p27蛋白表达水平与乳腺良性肿瘤差异无统计学意义(P>0.05)，但CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平高于乳腺良性肿瘤，且与弹性模量值呈正相关，p21蛋白表达水平低于乳腺良性肿瘤，且与弹性模量值呈负相关(P<0.05)。这提示乳腺癌组织的弹性与增殖、侵袭基因表达水平有关，推测增殖、侵袭基因蛋白表达的变化可能会导致乳腺癌硬度增加，而通过SWE检查可以评估癌细胞的增殖、浸润情况。

综上所述，乳腺癌组织SWE参数弹性模量值较良性肿瘤组织增加，并且与肿瘤病理特征改变、增殖和侵袭基因表达异常有关。