激素对AECOPD 患者诱导痰sIg A变化的影响

宋甲富 徐采云 李家树 赵媛 李春华

1徐州医科大学附属连云港市第一人民医院呼吸科222000;2徐州医科大学附属连云港市第一人民医院危重症医学科222000;3徐州医科大学附属连云港市第一人民医院病理科222000

分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulin A,sIg A)是支气管黏膜免疫的主 要 成 分, 是 由 2 个 免 疫 球 蛋 白 A(immunoglobulin A,Ig A)单体、J链与多聚免疫球蛋白受体 (polymeric immunoglobulin receptor,PIg R)结合而成,具体形成机制为黏膜下淋巴组织合成并分泌Ig A 单体及J链,2个Ig A 单体通过与J链连接进一步通过胞吞方式进入支气管上皮细胞,然后再与支气管上皮细胞表达的PIgR 结合就形成所谓的PIgR-Ig A 复合体,进一步分泌到支气管上皮细胞形成sIg A (包含两个Ig A 单体,J链和来自PIgR 的分泌片段 (secretory component,SC)。既往认为sIg A 直接与细菌、病毒等病原微生物结合而发挥抗感染作用。但近年来发现,sIg A在COPD的发生、发展过程中亦起到重要作用。

COPD 是以持续气道炎症和不可逆的气流受限为特点,发病机制至今不是十分明确,目前认为吸烟是其发生的重要原因,但是这一原因不能解释戒烟后炎症的持续进展和气道的继续重塑。2001年Pilette等[1]首先报道了COPD 患者气道表面的SC较正常人显著减少;紧接着Polosukhin等[2]证实COPD 患者支气管上皮PIgR 表达也减少,这就证明了sIg A 可能与COPD 存在一定关系;研究人员进一步利用原代细胞培养技术发现来自于COPD患者的支气管上皮细胞相比正常人所表达PIgR 亦显著减少,来自正常人的支气管上皮细胞分化良好,能够显著增加PIgR 的表达,而sIg A 也可以通过转化生长因子β信号通路促进支气管上皮分化[2-3],这也就说明sIg A 可能参与了COPD 的发展。2016年Richmond 等[4]利用基因敲除技术证实PIg R 基因敲除后的小鼠 (气道先天缺乏sIg A)经脂多糖刺激可以发展形成肺气肿模型,进一步证实sIg A 不但参与了COPD 的发展同样参与了COPD 的发生。

尽管目前研究对sIg A 在COPD 的发生、发展过程中的作用有所认识,但是对其在急性加重期的表达及变化情况仍然知之甚少,且急性加重是COPD 疾病发展过程中的重要事件,每次急性加重都会导致第1秒用力呼气容积 (forced expiratory volume in one second,FEV1)的下降和死亡的发生且消耗大量的医疗资源[5],因此对COPD 急性加重 (acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)的关注意义重大。sIg A 的生成分泌和PIgR 的表达直接相关,从基因水平考虑某些炎症因子如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素γ (interferon γ,IFN-γ)、IL-4、能够刺激PIgR 基因的启动子区域从而增加PIgR 表达[6]。既往我们的研究发现即使是吸入激素也能够降低气道sIg A 的表达[7],而激素的使用又是缩短急性加重病程和提高治疗成功率的重要手段;AECOPD 经激素抗炎治疗后,炎症因子 (TNF-α、IFN-γ、IL-4)下降,因此推测激素可能通过下调炎症因子减少sIg A 的表达。中性粒细胞对COPD 患者气道sIg A 分泌的影响是双重的,一方面低浓度可以通过分泌炎症因子促进sIg A 的分泌,另一方面高浓度又可以通过释放蛋白酶水解PIg R/SC复合物降低sIg A 的表达[8],先前很多研究发现COPD 患者经过治疗后炎症因子下降,中性粒细胞总数下降,这就使得我们对AECOPD 患者sIg A 的变化趋势难以确定,所以设计本试验观察sIg A 在COPD 急性加重过程中表达趋势及其与炎症细胞、炎症因子以及激素使用剂量的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择连云港市第一人民医院呼吸科2017 年1 月 至2018 年12 月 共44 例 确 诊AECOPD 患者。本研究符合人体试验伦理学标准并通过连云港市第一人民医院伦理委员会批准(LW201611001),研究对象知情同意并签署知情同意书。入组标准：符合慢性阻塞性肺疾病全球创议[9]2017 AECOPD 定义 (呼吸系统症状出现急性加重,典型表现为呼吸困难加重,咳嗽加剧,痰量增多或者痰液呈脓性,超出日常变异,并且导致需要改变药物治疗),自愿加入临床试验。排除标准：拒绝参加临床试验,诱导痰失败,合并肺炎,治疗期间加重。

1.2方法

1.2.1AECOPD 的处理及治疗 所有患者开始给予甲泼尼龙(40 mg 静滴,1次/d)抗炎治疗,允许病情好转后更换为强的松口服,允许患者临时使用氢化可的松治疗,给予头孢唑肟 (3 g 静滴,1次/12 h)抗感染治疗,复方异丙托溴铵(2.5 ml雾化吸入2次/d),吸入用布地奈德溶液(2 mg雾化吸入2次/d),茶碱缓释片(0.2 g口服2次/d)。分别在第2天、第4天和第10天收集患者诱导痰,且在第2、4、6、8、10天5个时间点行床边肺功能FEV1检测(图1)。

1.2.2AECOPD 治疗疗程 当达到出院标准时给予办理出院,因需要收集第10天诱导痰,因此住院时间最少10 d。具体出院标准：(1)临床医师认为患者可以适应家庭医疗;(2)患者能够使用吸入装置;(3)如果患者以前没有卧床,需能在室内行走; (4)患者能够进食,且睡眠不受呼吸困难影响;(5)患者临床稳定12～24 h。 (6)动脉血气分析稳定12～24 h。

1.2.3AECOPD 治疗转归 好转：达到出院标准;恶化：不能达到出院标准,疾病加重出院;死亡：呼吸心跳停止。

1.2.4诱导痰 利用3%盐水雾化吸入,嘱患者每隔5 min深吸气后呼气呼至2/3时咳痰(咳痰前先漱口),收集大概1 ml左右痰液终止。诱导痰尽量2 h内处理,如果不能及时处理,放4 ℃冰箱冷藏24 h 内处理。如果患者痰量较多,直接收集,无需雾化诱导。

1.2.5诱导痰处理及细胞计数和分类 (1)裂解：选取痰标本称重 (g),加入重量数值4 倍(ml)的黏液裂解剂0.1%二硫苏糖醇。37 ℃水浴10 min,同时震荡器进行震荡充分裂解。较浓的痰栓需要增加裂解时间。(2)震荡：充分使痰液与裂解剂混匀,促进裂解。(3)过滤：使用48目尼龙网,将充分裂解的痰液过滤,去除杂质。(4)牛鲍计数板计数每毫升痰的总细胞数,滤液1 000 r/min离心5 min,离心半径10 cm,留取上清液,-80 ℃冻存待测,细胞沉淀涂片后行HE 染色,光镜下对400个非上皮细胞进行分类计数。

1.2.6FEV1测定 嘱患者深吸气,最大、最快速度呼气,记录FEV1连续3次,取平均值。

1.2.7炎症因子及sIg A 的测定 TNF-α、IL-8、嗜酸粒细胞阳离子蛋白 (eosinophil cationic protein,ECP)、IL-4、IFN-γ、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及sIg A 均采用酶联免疫吸附试验法测定,试剂盒购买自上海兰基生物有限公司。

图1 导痰sIg A 与炎症因子变化 A：sIg A;B：MMP-9;C：IFN-γ;D：IL-8;E：ECP;F：TNF-α

1.3统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析,资料以±s 表示,多组间总体均数比较在方差齐时采用单因素方差分析one-way ANOVA方差不齐时用Welch 校正检验,两两比较方差齐时,用LSD,方差不齐时用Tamhane,P ＜0.05为差异有统计学意义。激素与sIg A 变化值相关性采用直线相关。

2 结果

收集44 例患者,男28 例,女16 例,年龄(67.23±18.50)岁,Ⅰ型呼吸衰竭18例,Ⅱ型呼吸衰竭26例。

为了验证炎症因子对sIg A 的影响,本实验检测了与PIgR 表达有关的TNF-α、IL-4、IFN-γ。同时检测了其他炎症因子如中性粒细胞趋化因子IL-8,中心粒细胞分泌的炎症因子MMP-9,以及嗜酸粒细胞相关炎症因子ECP,发现第4天诱导痰炎症因子TNF-α、ECP、IL-4、IFN-γ、MMP-9显著低于第2天,而第10天与第4天炎症因子水平比较均未见显著性改变,sIg A 在第10天的表达水平明显高于第4天,且第4天亦显著高于第2天(图1)。

第10天中性粒细胞总数较第4天无显著下降,细胞总数和嗜酸粒细胞数也未见显著改变,而第4天与第2天比较,上述指标均显著降低(图2)。

图2 诱导痰炎症细胞变化

FEV1在第2、4、6、8、10 天5 个时间点的检测值差异无统计学意义(图3)。

为了验证激素使用量和sIg A 浓度改变的关系,分析发现第4天至第10天激素使用剂量 (换算为强的松剂量)与这期间sIg A 浓度变化值呈负相关(r=-0.794,P ＜0.05);进一步分析发现第2天至第10天激素使用量与同期sIg A 浓度变化值亦呈负相关(r=-0.591,P ＜0.05)。

3 讨论

我们的研究结果表明AECOPD 诱导痰sIg A含量处于较低水平,给予抗感染、解痉、平喘治疗后浓度较前显著增高。但是sIg A 在急性加重期治疗的过程中水平的变化具体机制不清,本课题发现激素的使用剂量与气道局部sIg A 的含量改变相关。

图3 FEV1 的变化

入院第4天sIg A 含量较第2天明显升高,这时伴随着与PIgR 合成相关炎症因子 (TNF-α、IFN-γ、IL-4)的下降和中性粒细胞的下降。上述炎症因子能够通过作用于PIgR 的启动子区域增加PIg R 表达[10],因此炎症因子的下降应该导致PIgR 表达的进一步降低,从而导致sIg A 分泌量的下降,但结果却发现sIg A 较前上升,因此我们认为sIg A 水平在第4天的上升与中性粒细胞的快速下降有关,因为中性粒细胞快速下降可以减少蛋白酶的分泌从而减少对PIgR/SC 复合物的水解作用[8]。

有研究显示诱导痰IFN-γ、IL-8等炎症因子在治疗前期下降明显,治疗后期未再进一步下降[11],这与我们的研究结果一致,也说明激素对AECOPD 炎症治疗作用有限。

在试验第4天至第10天,激素治疗并没有进一步的改变气道炎症,而sIg A 水平仍然不断上升,考虑AECOPD 恢复过程中支气管上皮修复促进PIg R 表达,进一步导致sIg A 的合成增加,而sIg A 又可以促进支气管上皮细胞分化及修复形成良性循环[2-3]。但是我们也发现第4天至第10天的激素使用量与这期间的sIg A 变化值呈负相关,进一步分析发现第2天至第10天的激素剂量和第10天与第2天的变化值亦呈负相关,这说明激素的使用影响sIg A 的上升。

激素通过抑制NF-κB信号通路起到抗炎作用,而NF-κB信号通路的抑制恰恰导致PIgR 表达减少[10],后者是sIg A 形成的必要条件,这也许能够解释为什么激素会对sIg A 生成产生不利影响。

TORCH 试验首先报道了吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroids,ICS)可以增加肺炎发生率[12],随后的研究发现ICS同样可以增加肺结核发生率[13],考虑原因可能是ICS能够降低气道黏膜局部免疫力,而sIg A 是气道黏膜免疫最重要的免疫球蛋白,既往我们的研究发现即使是吸入3个月的沙美特罗替卡松吸入剂 (50/250μg)亦能够显著减低诱导痰sIg A 的含量[7],本试验结果进一步证实AECOPD 患者更长时间的全身激素使用也对sIg A 的分泌构成不利影响。

REDUCE[14]研究结果提示AECOPD 短疗程激素与长疗程激素疗效相当,且高血压、高血糖等不良反应显著减少,因此GOLD 对于AECOPD 患者推荐短疗程激素,亦有相关研究提示提高sIg A含量可以延缓COPD 急性加重[15],因此本课题结果进一步支持AECOPD 患者更适合短疗程激素治疗。

AECOPD 肺功能的检测提示在治疗的第2天以后FEV1未见显著上升,与Leuppi等[14]的研究结果一致。这说明FEV1的检测在AECOPD 意义不大。当然我们没有检测FVC、MVV 等其他指标,这是需要进一步改进的地方。

总之,AECOPD 患者经治疗后其诱导痰sIg A浓度可以得到提高,可能与中性粒细胞炎症的下降相关。更多激素使用量并没有进一步降低中性粒细胞炎症,反而影响sIg A 的升高。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突