皮燕麦多酚提取物对冷却猪肉抗蛋白氧化评价

杨文平，郝教敏，靳明凯，郭安娜，朱月，杨珍平*

(1.华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210；2.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；3.山西农业大学 农学院，山西 晋中 030801)

肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)约占猪肌肉蛋白总量的50%[1]，其结构的改变，如羰基和巯基含量变化[2,3]，影响肉类的最终品质。肉类制品在加工销售过程中，极易发生脂质蛋白氧化，可能产生一些有毒化合物[4,5]。为了延长其货架期，人工合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等得到广泛应用[6]。但是，人工合成抗氧化剂长期使用存在的安全隐患引起人们的关注和排斥，开发应用天然抗氧化剂，如黄酮类、多酚类化合物等，已成为食品科技工作者新的研究课题[7-9]。燕麦分裸燕麦(Avenanuda)和皮燕麦(Avenasativa)两类。在我国，皮燕麦以饲用为主，裸燕麦以食用为主。燕麦富含多种营养成分和抗氧化生物活性物质，如蛋白、脂肪、膳食纤维、多酚化合物、维生素E等[10-12]。研究表明，燕麦多酚具有很强的清除自由基能力及铁还原能力，能够防止脂质过氧化和动脉粥样硬化发生，提高机体内酶活性[13,14]。纵观前人研究发现，燕麦多酚提取和体外抗氧化性能等方面的研究较多[15-17]，但关于燕麦多酚在肉类制品中抗蛋白氧化机理研究鲜有报道[18,19]。本研究拟将皮燕麦多酚提取物应用于冷却猪肉，检测冷却猪肉中肌原纤维蛋白及其羰基和总巯基含量的变化，评价皮燕麦多酚提取物抗蛋白氧化性能，为皮燕麦开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验原料与试剂

皮燕麦(AvenasativaL.)品种OA1019-1的籽粒：由山西农业大学农学院黄土高原作物研究所提供的引自加拿大的适应性品种。

新鲜猪背最长肌：购于山西农业大学双汇冷鲜肉店。

2,4-二硝基苯肼(DNPH)：天津市登峰化学试剂厂；盐酸胍：上海蓝季生物有限公司；氯化钠、氯化镁、磷酸氢二钠、石油醚和乙酸乙酯：天津市北辰方正试剂厂；无水乙醇、无水碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾钠和三氯乙酸(TCA)：天津市天力化学试剂有限公司；上述试剂均为分析纯。

福林酚、茶多酚、牛血清蛋白、三羟甲基氨基甲烷(THAM)和乙二胺四乙酸(EDTA)：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸：大海埃彼化学试剂有限公司；上述试剂均为标准品。

1.2 仪器设备

HCP-100华晨高速多功能粉碎机 浙江省永康市金穗机械制造厂；DZKW-D-2电热恒温水浴锅 上海市沪西机电厂；Rotavapor R-3旋转蒸发仪 瑞士Biichi公司；PL3000冻干机 北京水方仪涛商贸有限公司；FA25型高剪切分散乳化剂 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；TDL-4离心机 上海安亭科技仪器厂；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；Allegra X-30R台式冷冻离心机 北京德全兴业商贸有限公司；WFJ2100型可见光分光光度计 Unique仪器有限公司；HNY-200D恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 皮燕麦多酚提取物及冻干粉的制备

根据课题组前期的最佳工艺提取皮燕麦多酚。将优选后的皮燕麦籽粒，加适量的水，风干、粉碎、过筛，得到皮燕麦面粉。准确称取一定量的皮燕麦面粉，用66%无水乙醇，按1∶10料液比，于66 ℃的恒温水浴锅中浸提123 min，冷却至室温后过滤，所得滤液即为皮燕麦多酚提取液。采用福林-酚比色法测定燕麦多酚含量。将滤液浓缩冻干，即得皮燕麦多酚冻干粉，计算冻干粉中多酚含量为6.01%，放入2～4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.3.2 冷却猪肉处理及实验设计

将新鲜猪背最长肌去除筋膜、脂肪，搅碎成肉糜，平均分成3份，每份重约300 g。将0.09 g茶多酚、0.15 g皮燕麦多酚分别溶于20 mL无菌蒸馏水中，分别加入到2份肉糜中，剩下的1份肉糜加入20 mL无菌蒸馏水，搅拌均匀后，静置2 h，即可得到空白组CK、含茶多酚300 mg/kg的阳性对照组和含皮燕麦多酚500 mg/kg的处理组肉样。

取3组处理好的肉样各50 g,分别置于聚苯乙烯塑料托盘中，密封，在(1±1)℃冰箱中冷藏。在冷藏期间的0，1，3，5，7 d，提取肉样肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)，测定蛋白浓度、巯基含量和羰基含量。重复进行3次。

1.3.3 评价指标测定

参照文献[20]的方法提取肉样肌原纤维蛋白。方法如下：准确称量肉样5 g于100 mL离心管中，加入10 mmol/L磷酸盐缓冲液(含NaCl、MgCl2和 EDTA，pH 7.0)20 mL匀浆后，在4 ℃离心15 min，弃上清，重复3次；加入0.1 mol/L NaCl洗液40 mL匀浆后，离心15 min，弃上清，重复2次；再加入洗液，匀浆后用两层纱布过滤，将滤液用0.1 mol/L HCl调pH至6.2左右，离心15 min，弃上清，所得膏状物即为MP，冰浴保存，备用。

1.3.3.1 MP含量测定

采用双缩脲法绘制牛血清蛋白标准曲线[21]，其回归方程为y=0.0396x+0.0151(R2=0.9937)。取1 mL蛋白溶液，加入4 mL双缩脲试剂和3 mL石油醚充分混匀，离心，用注射针小心将下层溶液吸出，在540 nm处测定吸光度，根据回归方程计算MP含量。

1.3.3.2 MP羰基含量测定

采取2,4-二硝基苯肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH)法测定[22]。量取4份25 mg/mL蛋白溶液100 μL于10 mL塑料离心管中，在3个管中分别加入10 mmol/L DNPH溶液2 mL，剩下的管中加入2 mol/L盐酸2 mL(作对照)，混匀，于4 ℃静置1 h，然后分别加入20% TCA溶液2 mL，混匀，离心，弃上清，再分别加入4 mL乙醇和乙酸乙酯(1∶1)混合液，混匀，离心，弃上清，重复2次。沉淀风干后，分别加入3 mL 6 mol/L盐酸胍，在50 ℃下保温60 min，在370 nm下测吸光值。

式中：A370为370 nm下吸光度；2.2×104L/(mol·cm)为摩尔吸光系数；106为mmol/mg～nmol/mg的单位转换系数；C为用盐酸胍做空白在280 nm下测得的蛋白浓度；羰基含量以nmol/mg蛋白表示。

1.3.3.3 MP总巯基含量测定

参照文献[23]的方法，采用5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)法测定。根据下列公式计算总巯基含量。

式中：A412为412 nm下吸光度；1.36×104L/(mol·cm)为摩尔吸光系数；106为mmol/mg～nmol/mg的单位转换系数；C为采用考马斯亮蓝法在595 nm下测得的肉样蛋白浓度[24]；巯基含量以nmol/mg蛋白表示。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel进行数据整理并制表、作图；分别应用Statix 8.1和SigmaPlot 10.0进行方差分析和显著性分析。结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 不同处理对冷却猪肉MP浓度的影响

不同处理对冷却猪肉MP浓度的影响见图1。

图1 不同处理对贮藏期内冷却猪肉MP浓度的影响Fig.1 Effects of different treatments on MP content of chilled pork during storage

注：小写字母不同表示同一处理随贮存时间延长差异显著(P<0.05)；大写字母不同表示相同贮藏时间下不同处理间差异显著(P<0.05)；下同。

由图1可知，随着贮藏时间的延长，各组冷却猪肉MP浓度均呈明显的下降趋势(P<0.05)。可能的原因是冷却猪肉中自由基与蛋白和肽的反应会导致蛋白质肽链、氨基酸侧链的修饰和蛋白质分子间的共价交联，产生大量羰基和降低巯基含量，这与本研究的测定结果相一致。在同一贮藏期内，冷却猪肉MP浓度由大到小依次为茶多酚组>皮燕麦多酚组>空白组；贮藏3 d后，空白组比多酚组显著降低了MP浓度(P<0.05)，表明茶多酚和皮燕麦多酚能抑制猪肉蛋白的氧化。贮藏7 d，皮燕麦多酚组较茶多酚组冷却猪肉MP浓度显著降低(P<0.05)，表明茶多酚抑制猪肉氧化效果优于皮燕麦多酚。

2.2 不同处理对冷却猪肉MP羰基含量的影响

羰基含量最直接指示蛋白质氧化的程度，这也被广泛用于测量不同氧化胁迫下的蛋白质氧化程度，常被作为蛋白质氧化的灵敏指标[25]。在Fenton反应体系中,蛋白表面氨基酸残基侧链基团被氧自由基攻击，肽键断裂并且产生羰基化合物及其衍生物[26]。羰基的形成是被氧化肌原纤维蛋白中的一个显著变化。不同处理对冷却猪肉MP羰基含量的影响见图2。

图2 不同处理对冷却猪肉贮藏期内MP羰基含量的影响Fig.2 Effects of different treatments on MP carbonyl content of chilled pork during storage

由图2可知，贮藏0～1 d，各组冷却猪肉MP羰基含量均处于较低水平，低于0.5 nmol/mg，没有明显差异(P>0.05)。随着贮藏时间延长，猪肉MP羰基含量均呈显著增加趋势(P<0.05)，说明贮藏时间与羰基形成有密切关系，这与陈洪生等[27]的研究结果一致。贮藏7 d，各组羰基含量增加幅度不同，从高到底依次为空白组>皮燕麦多酚组>茶多酚组，空白组MP羰基含量显著高于其他两个多酚组(P<0.05)，表明空白组MP氧化程度最严重，添加多酚具有一定的抗氧化作用，皮燕麦多酚和茶多酚作用相似。可能的原因是多酚与MP共价交联结合，阻碍了氧化剂的作用部位，或者有效清除了活性氧自由基，阻断蛋白质羰基链式反应，抑制蛋白羰基的形成，从而降低了羰基含量。贾娜等[28]研究表明添加没食子酸可以降低肌原纤维蛋白的羰基含量，与本研究结果一致。

2.3 不同处理对冷却猪肉MP总巯基含量的影响

巯基含量是判定蛋白氧化的另一个重要指标，含量越低，说明蛋白氧化的程度越高。不同处理对冷却猪肉MP总巯基含量的影响见图3。

图3 不同处理对冷却猪肉贮藏期内MP总巯基含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on MP total sulfhydryl content of chilled pork during storage

由图3可知，0 d时，3组猪冷却肉MP总巯基含量均较高，达到90 nmol/mg以上；随着贮藏时间延长，MP总巯基含量总体均呈显著下降趋势(P<0.05)，贮藏7 d时，3个处理组MP总巯基含量不超过60 nmol/mg，说明贮藏时间对蛋白巯基含量有显著影响，这与陈洪生等的研究结果一致。蛋白巯基含量下降的主要原因可能是蛋白质降解导致其空间结构发生改变，致使埋藏在分子内部的巯基暴露出来，半胱氨酸残基中的巯基(SH-)在氧自由基攻击下形成二硫键(-S-S-)，引起蛋白发生氧化。巯基形成二硫键最早是以自由基为媒介发生的[29]。也有研究报道多酚类化合物可以和巯基交联结合形成巯基-醌加成物,从而引起巯基含量下降[30]。在同一贮藏期内，MP总巯基含量以茶多酚组最高，皮燕麦多酚组次之，空白组最低，茶多酚组与空白组具有显著差异(P<0.05)。贮藏5 d时，皮燕麦多酚组MP总巯基含量显著高于空白组(P<0.05)。说明添加多酚类物质在一定程度上可以保护肌原纤维蛋白结构不被自由基所攻击。可见，皮燕麦多酚具有抑制冷却猪肉蛋白氧化的作用。

Yang等研究表明[31]，冷藏期间，高氧气调包装猪肉随着脂肪的剧烈氧化，伴随发生蛋白的剧烈氧化，羰基含量显著增加，巯基含量明显减少；添加茶多酚可以部分抑制蛋白氧化。本研究结果与Yang等的研究结果相似，以茶多酚为阳性对照，皮燕麦多酚同样具有一定的抗蛋白氧化性，可以抑制羰基化合物形成和巯基被氧化。有关多酚化合物对蛋白质的作用机理需进一步深入研究。

3 结论

通过实验研究发现，在冷藏7 d时，各组冷却猪肉肌原纤维蛋白都出现明显的蛋白氧化，羰基含量增加，总巯基含量下降，空白组的氧化程度显著高于茶多酚组和皮燕麦多酚组(P<0.05)，因此添加皮燕麦多酚可以在一定程度上减少羰基的形成和防止巯基在冷藏过程中的丢失，有效延缓MP氧化程度，提高冷却猪肉抗蛋白氧化性。将皮燕麦多酚作为天然抗氧化剂，对生产出安全、优质的肉制品具有重要意义。