基于网络药理学分析柴胡疏肝散治疗乳腺癌的作用机制

董阿茹汗， 思志强， 张莹

天津中医药大学第一附属医院，天津 300193

乳腺癌属于中医“乳岩”“乳石痈”“奶岩”范畴，关于其发病机制，朱丹溪《格致余论》中提到：“肝气横逆，遂成隐核”。宋代陈自明《妇人大全良方》：“乳岩由于忧思郁结，所愿不遂，肝脾气逆，以致经络闭塞，结积成核”。提示乳腺癌的发生、发展与情志不畅、肝气郁结密切相关。柴胡疏肝散出自叶文龄《医学统旨》，为疏肝理气代表方，具有疏肝解郁、理气化瘀之效。在临床中，柴胡疏肝散多用于治疗肝郁气滞型乳腺癌，并作为乳腺癌中医治疗的基础方得到广泛应用[1，2]，但其作用机制尚不明确。本文根据中药复方多成分、多靶点的特性，通过网络药理学分析方法，对柴胡疏肝散治疗乳腺癌作用机制进行分析，为临床应用及实验验证提供研究思路和方向。

1 研究方法

1.1 柴胡疏肝散活性成分搜集通过中药系统药理学数据库分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，检索柴胡疏肝散中药物柴胡、香附、川芎、陈皮、枳壳、白芍、甘草化学活性成分数据，由于中药进入体内后多通过有效成分入血发挥作用，故根据药物动力学参数口服生物利用度OB≥30%，药物相似性DL≥0.18对成分信息进行筛选，筛选出有效活性成分。

1.2 有效活性成分靶点整理使用TCMSP数据库及VBA工具收集成分靶点信息，并通过UniProt Knowledgebase数据库(https：//www.uniprot.org/)对靶点进行筛选及名称规范。利用Cytoscape 3.2.1软件Network Analysis功能对靶点进行拓扑分析以筛选出核心靶点，筛选出Degree≥10的靶点为核心靶点。

1.3 乳腺癌相关靶点收集通过疾病名称搜索TTD数据库(http：//db.idrblab.org/ttd/)、Genecards数据库(https：//www.genecards.org/)获取乳腺癌相关基因及靶点，整理为疾病靶点数据库。

1.4 构建蛋白相互作用图通过Venny 2.1.0工具画出筛选后药物成分靶点及疾病靶点韦恩图，获取二者共同作用靶点。将靶点信息导入String数据库(https：//string-db.org/)，将物种限定为人，获得蛋白相互作用信息并将其导入Cytoscape 3.2.1软件进行网络分析，根据节点degree值及相互作用关系设置节点的大小、颜色及边的粗细及颜色。

1.5 功能富集分析(Gene Ontology，GO)及通路分析基于 DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)，对靶点进行GO功能注释，包括生物过程(Biological Process，BP)、细胞组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)以了解靶点参与的生物学过程，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析以预测靶点可能参与的信号通路，将所获得的数据信息借助R 3.6.1软件及R Studio软件绘制气泡图。

1.6 化合物-靶点-疾病网络图使用Cytoscape 3.2.1软件构建柴胡疏肝散活性成分-靶点-乳腺癌PPI网络图。

2 结果

2.1 柴胡疏肝散活性成分与靶点收集

通过搜集TCMSP数据库并经过筛选，共得到符合OB≥30%，DL≥0.18条件的化学成分157个(见表1)，其中柴胡17个、香附18个、川芎7个、陈皮5个、枳壳5个、白芍13个、甘草92个，对成分靶点进行整理后，共得到165个作用靶点，提取Degree≥10的靶点，获得成分中核心靶点共44个。

2.2 乳腺癌靶点筛选及构建共同靶点韦恩图

通过搜索TTD数据库，确立了138个与乳腺癌相关的治疗靶点，Gene Cards数据库中相关基因299个，删除重复靶点，共得到乳腺癌相关靶点及基因共407个。建立柴胡疏肝散与乳腺癌相关靶点韦恩图(见图1)，获取二者共同作用靶点15个，其中包括多种激素受体如雄激素受体(Androgen Receptor，AR)、雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR)、孕激素受体(Progesterone Receptor，PGR)等及多种酶及因子(见表2)。

2.3 构建蛋白互作图

将15个共同靶点信息导入String数据库，获得蛋白互作信息，将其导入Cytoscape 3.2.1软件获得蛋白互作图(图2)，图中共有15个节点，41条边，每个节点代表一个蛋白质，线条代表二者间相互作用，节点形状越大，代表其degree值更高，线段越粗，代表二者间相互作用关系更强。如图可知，JUN、PTGS2、ESR1为3个关键靶点。

2.4 构建药物活性成分-疾病-靶点网络

运用Cytoscape 3.2.1构建柴胡疏肝散活性成分-疾病-靶点网络(见图3)，图中左侧圆圈内节点为柴胡疏肝散157种有效活性成分，右侧小圆圈内节点为15个柴胡疏肝散与乳腺癌共同作用靶点。

表1 柴胡疏肝散活性成分表Table 1 Active ingredients list of Chaihu Shugan Powder

（续表1)

（续表1)

（续表1)

图1 柴胡疏肝散活性成分靶点与乳腺癌相关靶点关系的韦恩图Figure 1 Venn diagram of the relationship between the active components of targets of Chaihu Shugan Powder and the targets of breast cancer

2.5 GO功能注释及分析

基于DAVID数据库，对靶点进行GO功能注释，通过GO分析，共涉及52个生物过程、6种细胞成分、27个分子功能，筛选前10个作为关键功能注释信息并绘制气泡图如图4、图5、图6所示。柴胡疏肝散主要参与调控RNA聚合酶启动子转录、细胞间信号传导、药物反应、类固醇激素介导的信号通路等10个生物过程，相关基因靶点富集于细胞核、核浆、细胞质、蛋白质复合物6种细胞成分，发挥类固醇激素相关受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、特定序列DNA结合等10个分子功能。

表2 柴胡疏肝散与乳腺癌共同作用靶点Table 2 Common targets of Chaihu Shugan Powder and breast cancer

图2 蛋白互作图Figure 2 Protein interaction diagram

2.6 KEGG通路分析

图3 柴胡疏肝散活性成分-疾病-靶点网络图Figure 3 The network diagram of active componentsdisease-targets of Chaihu Shugan Powder

基于DAVID数据库，对靶点进行通路富集分析，共获得22条富集通路，为获得关键富集通路进行分析，选取前10条通路并绘制气泡图，结果如图7显示，图中X轴为基因比例(Gene Ratio)，Y轴为富集通路名称，点的大小代表涉及基因数目，点的颜色代表P值高低。可见，柴胡疏肝散核心靶点主要富集于癌症相关通路、催乳激素、雌激素相关通路、脂肪细胞脂解通路、B细胞受体信号通路、HIF-1信号通路等，通过影响激素信号通路及抗血管生成相关信号通路发挥抗癌作用。

图4 GO注释分析生物过程气泡图Figure 4 The bubble diagram of biological process of GO analysis

图5 GO注释分析细胞组成气泡图Figure 5 The bubble diagram of cellular component of GO analysis

图6 GO注释分析分子功能分析气泡图Figure 6 The bubble diagram of molecular function of GO analysis

图7 KEGG通路分析气泡图Figure 7 The bubble diagram of KEGG pathway analysis

3 分析

柴胡疏肝散为临床疏肝解郁、理气化瘀代表方，方中柴胡疏肝解郁为君药，香附梳理三焦气机，川芎活血通络，陈皮、枳壳理气健运脾胃，甘草调和诸药。临床广泛用于治疗妇科疾病中肝郁气滞、肝胃不和患者，女子以肝为先天，乳房作为肝经所过之处，相关疾病的发生发展与情志不畅、气机郁结密切相关，且乳腺癌患者患病后多情志抑郁不畅，故临证多通过疏肝散结法来治疗乳腺癌。

蛋白互作图中可见靶点间相互作用关系，经过筛选其主要关键靶点为JUN、PTGS2、ESR1。JUN是细胞周期正常进行的必要组成成分，在正常情况下少量表达c-JUN蛋白，c-JUN基因受到刺激后发生异常表达，产生过量c-JUN蛋白，与c-Fos蛋白形成AP-1，影响细胞分化、增殖及凋亡[3]，在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌中可见c-JUN蛋白过表达。有研究发现，c-JUN基因启动子区位点rs4646999可能通过增强c-JUN蛋白表达影响肠癌预后[4]。PTGS2为前列腺素G/H合酶2，是前列腺素合成的主要限速酶，PTGS2蛋白的上调与细胞粘附增加、抗凋亡、血管生成相关，在高密度的胶原基质乳腺上皮细胞中可见PTGS2表达增加，与乳腺密度升高相关，参与促进癌细胞转移[5]。ESR1基因为雌激素受体1基因，其编码ERα蛋白，与雌激素相结合进而调节激素水平。提示柴胡疏肝散可能通过调控细胞周期进程、血管生成、激素水平影响乳腺癌进程。

根据KEGG分析，柴胡疏肝散相关靶点主要富集于癌症相关通路、催乳激素、雌激素相关通路、脂肪细胞脂解通路、B细胞受体信号通路、HIF-1信号通路等，通过影响激素信号通路及抗血管生成相关信号通路发挥抗癌作用。乳腺癌是激素依赖性肿瘤，肿瘤细胞的生长受多种激素分泌的影响，其中雌激素对乳腺癌的影响不言而喻，75%的乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，内分泌治疗是临床主要治疗手段之一。催乳素与乳腺癌的发生发展亦密切相关，催乳素(Prolactin，PRL)与受体结合后可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，在部分乳腺癌组织中可见PRL表达升高，乳腺癌细胞还可以通过自分泌或旁分泌PRL以促进自身增殖、浸润与转移[6]。PRL可介导PRLR-JAK/STAT5通路，增强雌激素敏感性，协同IGF-I、EGF家族配体激活下游通路诱导ERα磷酸化，促进肿瘤细胞分化[7]。脂代谢功能紊乱和脂质分解障碍是导致肥胖的主要原因，肥胖是乳腺癌的危险因素之一。脂肪组织含有芳香化酶可产生雌二醇，并且脂肪组织也是肿瘤微环境中重要组成部分，与正常脂肪组织相比，肿瘤周围脂肪组织发生了一系列变化，产生了不同的细胞类型，还可分泌多种因子促进癌细胞增殖及转移，如血管内皮生长因子、瘦素、肿瘤坏死因子等[8，9]。HIF-1是存在于人体内缺氧条件下的重要转录因子，缺氧环境可诱导HIF-1作用于靶基因血管上皮生长因子，可促进内皮细胞增殖，参与肿瘤新生血管生成，促进肿瘤侵袭、转移等过程[10]。ErbB受体络氨酸激酶家族在多种肿瘤中异常表达，ErbB 1、ErbB 2异常活化与肿瘤新生血管生成相关，促进肿瘤细胞增殖、分化[11]。由上可知，柴胡疏肝散可通过调节激素相关信号通路影响激素水平发挥抗乳腺癌作用，而对于三阴性乳腺癌患者，对内分泌治疗不甚敏感，但临证中，在以“谨守病机”为主的辨证治疗原则下，柴胡疏肝散对于此种类型患者亦表现出良好的临床疗效。宋小青等[12]人观察柴胡疏肝散加减联合化疗维持治疗三阴性乳腺癌患者能有效提高患者5年无病生存率，减少复发转移风险。三阴性乳腺癌患者在常规化疗基础上联合柴胡疏肝散可延长患者生存期，改善生存质量[13]。

综上，本文应用网络药理学的分析方法，对柴胡疏肝散与乳腺癌作用靶点之间进行了分析及网络靶点图构建，结果显示，柴胡疏肝散中活性成分作用于多个靶点，参与多种生物过程及信号通路，其中以影响激素水平及抗血管生成为主，干扰肿瘤进程。但本研究仍存在一定的局限性，如未针对药物组方原则、配伍关系进行进一步分析，且仍需开展更多的临床研究及动物实验对柴胡疏肝散治疗乳腺癌的作用机制及靶点加以验证。