褚橙精油纳米乳的制备及抑菌性

刘如楠， 黄 凯， 管 骁*， 李 森， 刘 静， 宋洪东

（1.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海200093；2.上海海事大学 信息工程学院，上海200135）

褚橙是云南著名特产，以味甜皮薄而著称，含有大量维生素C，营养价值较高。柑橘类精油是最重要的柑橘类副产品，主要从果皮中提取，具有特殊芳香和抗菌、抗炎、抗氧化等性能[1-2]，因此被广泛应用于食品和化妆品行业中[3-4]。随着人们健康意识的提高，消费者对天然食品添加剂的需求不断增长，而褚橙精油因其天然性而备受青睐。但褚橙精油通常具有柑橘类精油的稳定性差、易挥发、水溶性差等通病，因此该精油的应用受到很大程度的限制[1，5]。

水包油（O/W）纳米乳被广泛报道可用于解决精油溶解度的问题[6]。纳米乳液是液滴尺寸在20～300 nm之间的乳液[7]。纳米乳是热力学不稳定，但动力学稳定的系统[8]。这种体系由于表面活性剂或其他乳化剂的存在而使油水界面张力降低，从而使乳液稳定。通过将精油乳化，亲脂性成分可以快速分散到水基食品系统中。此外，由于优异的分散性、稳定性以及渗透能力，纳米乳的活性可以得到改善[1]。

本研究的目的是分析褚橙植物精油的化学成分，制备褚橙精油纳米乳液并提升其稳定性，以及比较乳液与纯精油的抗菌活性差异。结果显示，以Tween 80和Span 80复配质量比为1∶2作为表面活性剂制备的褚橙精油乳液稳定性、分散性良好，并且抗菌性显著高于褚橙精油，从而解决了褚橙精油在生产加工中水溶性差的问题，并且为褚橙精油在工业中作为添加剂、防腐剂等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

褚橙：购于超市；Tween 80、Span 80、二甲基亚枫：国药控股化学试剂有限公司产品；大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：所有供试细菌均来源于上海理工大学微生物实验室；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，蒸馏水 1 000 mL；pH 7.2～7.4。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水设备：美国密理博公司产品；流变仪：美国TA公司产品；Agilent 7890A GC-5975c气相色谱质谱联用仪：Agilent公司产品；HPINNOWAX 毛细管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）：Agilent公司产品；多角度激光散射粒度分析仪：美国布鲁克海文仪器公司产品；马尔文激光粒度仪：英国马尔文仪器有限公司产品；多重光散射仪Turbiscan MA 2000：法国Formulaction公司产品；高速剪切机（ULTRA-TURRAX T18）：德国IKA公司产品；透射电子显微镜（JEM-2100F）：日本电子株式会社（JEOL）产品；立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂制造。

1.3 实验方法

1.3.1 褚橙精油的制备 称取一定量的褚橙皮，适当剪碎，置于Clevenger型装置中，在100℃下蒸馏来获得精油。将得到的精油与水分离，用无水Na2SO4干燥，并在4℃下储存。

1.3.2 气相色谱-质谱分析 通过GC-MS分析鉴定褚橙精油的成分[9]。色谱条件：色谱柱型号为HPINNOWAX 毛细管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序设定为：40℃开始并保持5 min，然后以8℃/min的速度升至250℃，并保持5 min，分离比为5∶1。载气为氦气，流速设定为1 mL/min。质谱条件：EI电离源为70 eV，离子源温度设定为230℃，四极温度为150℃，界面温度为250℃。扫描范围m/z为 30～400。

1.3.3 乳液制备 将Tween 80和Span 80以一定比例混合，然后以不同的质量浓度分别添加到2.5 g褚橙精油中。在25℃下以1 000 r/min的恒定速度磁力搅拌30 min来制备油相。将充分混合的油相滴定至搅拌的水相（去离子水）中。乳液的总质量保持恒定在50 g。滴定后，通过高速剪切机12 000 r/min剪切20 min制备褚橙精油纳米乳。

1.4 乳液测量

1.4.1 粒度分布 使用多角度激光散射粒度分析仪测定乳液粒径分布，设定温度25℃、散射角90°、样品平衡时间5 min、检测时间为5 min。在分析之前，将每种乳液样品稀释100倍。

1.4.2 ζ-电位的测定 通过使用马尔文激光粒度仪测定乳液的ζ-电位大小，测定温度为25℃，等待时间为120 s，平衡时间设置为180 s。每个样品至少测试了3遍，在分析之前，将每种乳液样品稀释100倍。

1.4.3 流变黏度 通过使用配备有同心圆筒夹具的剪切流变仪来测量具有不同表面活性剂浓度的褚橙精油纳米乳液的黏度。测量温度25℃，测定剪切速率从0.01～200 s-1递增，通过随附的软件记录每个剪切速率下的剪切黏度。

1.4.4 乳液的微观结构 用磷酸盐缓冲液稀释适量的纳米乳样品，然后滴到覆盖有碳膜的铜网中。负染色用质量分数为2.0%的磷钨酸进行40 s，使用JEM-2100F透射电子显微镜观察褚橙精油纳米乳的形貌。

1.4.5 乳液的背向散射（BS）曲线和Turbiscan稳定性指数（TSI） 使用Turbiscan MA 2000仪器，获得了乳液在24 h内的背散射光变化（BS）曲线。测量时，将褚橙精油纳米乳液样品置于20 mL样品池中，测量探头从样品池的底部到样品池的顶部每40 μm测量一次，在测试期间乳液保持稳定。此外，还获得了Turbiscan稳定性指数（TSI）以评估乳液的稳定性。

1.5 褚橙精油及乳液的抗菌活性

使用滤纸片法测定褚橙精油和乳液对3种供试细菌抑菌活性。纯精油用1%二甲基亚砜（DMSO）稀释到与乳液含油量相同，将供试细菌在营养琼脂上于37℃生长18～24 h。挑取一环接种到灭菌的培养基中，制备细菌悬浮液，将100 μL的试样涂布在营养琼脂固体培养基上。将培养基分为3个区域，在各个区域中间放置准备好的6 mm的滤纸片，移液枪分别吸取10 μL稀释的纯精油，褚橙精油纳米乳液及1%的DMSO（对照）滴至滤纸片中间，迅速盖上培养皿盖。并将平板在37℃下培养24 h。平行3次，计算并比较精油和乳液抑制区直径。

1.6 统计分析

所有实验和测量均为3份，并将结果记录为平均值和标准偏差。使用SPSS Statistics Software（IBM）对数据进行ANOVA差异显著性分析，p＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 褚橙精油纳米乳的制备

2.1.1 不同表面活性剂的复配比对褚橙精油纳米乳粒径分布和ζ-电位值的影响 选用Tween 80与Span 80作为本实验的表面活性剂，将 Tween 80与Span 80 按照 1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1 的质量比分别混合均匀，将不同比例的混合表面活性剂加入到2.5 g褚橙精油中并在磁力搅拌器上充分搅拌，混合均匀后，以1 mL/min的速度加入到水相。体系总质量为50 g。用高速剪切机剪切20 min，得到均匀的纳米乳液，测定粒径和ζ-电位大小。ζ-电位的大小提供了乳液体系潜在稳定性的指标[10]，绝对值较高的ζ-电位颗粒之间相互排斥。ζ-电位显示出物理稳定性，ζ-电位的绝对值越大，乳液越稳定。

由图 1（a）可知，随着 Span 80比例的增大，纳米乳的粒径先减小后增大，当Tween 80∶Span 80从1∶0到 2∶1，粒径分布均呈现双峰，但平均有效粒径呈逐渐减小的趋势，当Tween 80∶Span 80从1∶1到0∶1有效粒径逐渐增大。Tween 80与Span 80质量比为2∶1时，达到最小粒径 70 nm。Tween 80∶Span 80为1∶2时，粒径分布最窄且呈现单峰分布。从图1（b） 可以看出，Tween 80 与 Span 80 的从 1∶0 到 1∶2时，ζ-电位的绝对值显著增加（p＜0.05），即稳定性显著增加。但当 Tween 80∶Span 80为 1∶2时再增加Span 80的量，ζ-电位的绝对值变化不显著 （p＞0.05）。由于粒径分布图在复配比为1∶2时为单峰分布，同时具有较高的ζ-电位绝对值。在随后的实验中选择Tween 80∶Span 80复配比1∶2制备乳液。

2.1.2 不同质量浓度表面活性剂对褚橙精油纳米乳粒径分布、ζ-电位值及流变黏度的影响 乳液的性质与其表面活性剂的质量浓度密不可分，因此研究了表面活性剂质量浓度对褚橙精油纳米乳液性能的影响。将Tween 80与Span 80按照复配比1∶2的比例混合均匀， 再按照质量浓度 1、2、3、4、5 g/dL分别加入到2.5 g褚橙精油混合均匀，以1 mL/min的速度加入到水相，使乳液的总质量为50 g。用高速剪切机剪切20 min测定乳液的粒径分布、ζ-电位以及黏度。

图1 不同表面活性剂复配比对褚橙油乳液粒径分布和ζ-电位值的影响Fig.1 Effect of different ratios of surfactants on particle size distribution and zeta potential of Chu orange essential oil emulsion

如图2（a）所示，表面活性剂质量较低的褚橙精油纳米乳含有较大的粒径，在较低的表面活性剂质量浓度下，其粒径分布呈双峰分布。这是由于当表面活性剂的用量较低时，表面活性剂不足以覆盖新油滴的表面，导致油滴相互碰撞和堆积而形成较大的液滴[7]。当表面活性剂质量浓度超过3 g/dL时，乳液液滴直径变化很小且分布变得不均。这是由于非离子表面活性剂稳定小液滴曲率的能力有限，在表面活性剂分子过量的情况下，限制了乳液液滴粒径的进一步减小[11]。

从图2（b）中ζ-电位图可以看出，随着表面活性剂质量浓度从1 g/dL增加到3 g/dL，乳液的ζ-电位绝对值显著增加（p＜0.05），褚橙精油纳米乳ζ-电位绝对值的增加为乳液液滴之间提供了高能量屏障，从而具有了良好的静电排斥[12]。但表面活性剂质量浓度从3 g/dL增加到5 g/dL，ζ-电位绝对值的变化不显著（p＞0.05），这与乳液粒径的变化趋势是一致的。因此，当表面活性剂质量浓度为3 g/dL时，褚橙精油纳米乳的粒径分布和ζ-电位基本保持不变。所以，质量浓度为3 g/dL的表面活性剂可以形成比较稳定的褚橙精油纳米乳液，此质量浓度最适合褚橙精油纳米乳的制备。

流变黏度影响乳液加工的适用性，直接关系到流体的稳定性[13]。因此研究表面活性剂质量浓度与褚橙精油乳液流变黏度之间的关系很有必要。如图3所示，随着表面活性剂的量的增加，乳液流变黏度增加，褚橙精油纳米乳的黏度范围在1.08～1.65 mPa·s，随着表面活性剂质量浓度的增加，乳液的黏度有所增加，表面活性剂的质量浓度从4 g/dL增加到5 g/dL时，可以看到黏度发生更大的增量，这是由于过量的表面活性剂迁移到水相中，导致褚橙精油纳米乳液的表观黏度急剧增加。

图2 表面活性剂质量浓度对褚橙精油乳液粒径和电位的影响Fig.2 Effect of surfactant concentration on the particle size and zeta potential of the Chu orange essential oil emulsion

图3 表面活性剂质量浓度对褚橙精油乳液流变黏度的影响Fig.3 Effect of surfactant concentration on rheological viscosity of Chu orange essential oil emulsion

2.1.3 不同剪切速度对褚橙精油纳米乳粒径分布、ζ-电位值及离心稳定性的影响 将质量浓度为3 g/dL的复合表面活性剂（Tween 80∶Span 80 为 1∶2）加入到2.5 g油相混合均匀，将混合物加入到一定量的去离子水中，使体系总质量为 50 g。分别以3 000、6 000、9 000、12 000、15 000 r/min 在高速剪切机上剪切20 min，测定粒径、ζ-电位及离心稳定性。由图4（a）可知，随着剪切速度的增加，纳米乳粒径逐渐减小，当剪切速度达到12 000 r/min时，纳米乳粒径分布变为单峰分布，此时，再增大剪切速率，乳液粒径变化很小，且乳液粒径变为双峰分布。这可能是由于剪切速率过大，使得乳液液滴过小，颗粒之间布朗运动加快、相互碰撞次数增多而发生液滴聚集现象。这说明并非剪切速率越大，乳液的分散性越好。从图4（b）可以看出，剪切速率从3 000 r/min增加到12 000 r/min时，ζ-电位绝对值显著增大 （p＜0.05），在15 000 r/min时ζ-电位绝对值反而减小。即褚橙精油纳米乳液在剪切速率为12 000 r/min时，纳米乳液达到最稳定的状态。

图4 剪切速率对褚橙精油乳液粒径和ζ-电位的影响Fig.4 Effect of shear rate on particle size and zeta potential of Chu orang essential oil emulsion

另外，将乳液在4 000 r/min室温条件下离心30 min，结果见图 5。 剪切速率为 3 000、6 000、9 000 r/min制备的乳液均有不同程度的明显分层，随着剪切速率的增大，分层高度降低，说明剪切速率对纳米乳液的稳定性的影响很大。当剪切速率达到12 000 r/min时，乳液未发生分层现象，所以最佳剪切速率选择12 000 r/min。

图5 不同剪切速率乳液的离心稳定性Fig.5 Centrifugal stability of emulsions at different shear rates

综上所述，制备最稳定的褚橙精油纳米乳液的优化条件为：表面活性剂选择Tween 80∶Span 80质量比1∶2、其质量浓度为3 g/dL、剪切速率为12 000 r/min，所得乳液的粒径为（135±0.76） nm，ζ-电位值为（-30±0.36）mV。

2.2 褚橙精油纳米乳的质量评价

图6 褚橙精油纳米乳的微观形态Fig.6 Microscopic morphology of Chu orange essential oil nanoemulsion

2.2.1 褚橙精油纳米乳的微观形态 通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米乳形态，结果见图6。发现褚橙精油纳米乳液滴分布均匀，呈圆球形，表明褚橙精油纳米乳分散较好。经测量纳米乳平均粒径为96 nm，比动态光散射法测得的稍小一些，由于动态光散射测得的是水合半径，此结果符合实际规律。

2.2.2 褚橙精油不稳定性分析 限制乳液应用的很大一个原因是乳液在储存期间不能保持稳定。通常，乳液去稳定化是由3种物理过程引起，即聚结、絮凝或奥斯特瓦尔德熟化和粒子重力迁移[14]。为了探究褚橙精油乳液的不稳定机制，并验证Tween 80和Span 80复配质量比为1∶2作为复合表面活性剂是否适合于形成褚橙精油纳米乳的小粒径和单峰分布的优质乳液，分别以Tween 80、Tween 80和Span 80复配质量比为1∶2，Span 80为表面活性剂制备了3种乳液，用Turbiscan得到了24 h之内3种乳液的TSI指数和BS的变化，比较3种不同的表面活性剂的稳定性行为，以分析乳液的不稳定性。

3种乳液的常温下的整体的TSI见图7。TSI值越大，稳定性越低。可以看到，仅以单一表面活性剂作为乳化剂所制备的乳液的稳定性要低于复配的表面活性剂所制备的乳液。

从图8可以看出，由于BS强度是位于管的特定高度和粒径的分散相体积的函数[14]，如果粒径大于入射波长，则BS强度随粒径的增加或粒子浓度的下降而降低；反之，BS随着粒子尺寸的增大而增大。底层中BS的下降表示底部浓度下降代表底部澄清的过程，而顶层中BS的增加则反应颗粒浓度的增加[15]。

从图8可知，仅以单一表面活性剂Tween 80或者Span 80（即图8(a)和8(c)）为乳化剂的乳液在24 h内BS变化较大。图8(a)和8(c)的底部BS变化和顶部BS变化均较强烈，这表明乳液底部澄清，乳液发生了严重的重力迁移，并且顶部BS增加，即乳液顶层发生油滴上浮现象。此外，以Tween 80为表面活性剂的乳液（图8(a)）的管中间部分BS水平降低，表明由于絮凝或聚结过程导致液滴尺寸增加。而Tween 80 和 Span 80 复配质量比为 1∶2（图 8(b)），变化最小，底部的BS没有明显变化，顶部的BS变化比底部略大。说明样品的不稳定性主要是由于样品顶部油滴发生上浮，中间部分BS水平几乎未发生变化。这些结果表明，褚橙精油乳液的不稳定性是由严重的重力分离引起的，其在底部产生澄清，在顶部产生奶油层，且以复配表面活性剂为乳化剂的乳液比以单一表面活性剂制备的乳液稳定性好。

图7 不同表面活性剂制备的乳液在24 h内TSI指数变化Fig.7 TSI index of emulsions prepared with different surfactants within 24 h

图8 不同表面活性剂制备的乳液在24 h内的BS变化Fig.8 BS changes in emulsions prepared with different surfactants within 24 h

2.3 褚橙精油抑菌性

2.3.1 GC-MC 通过GC-MS对褚橙精油的成分进行分析，鉴定了精油中的36种化合物，占出峰物质总数的95.41%。定量和定性分析结果见表1。精油的主要化合物是 D-柠檬烯 （52.96%）、β-蒎烯（11.85%）、α-蒎烯（9.19%）和顺式-（S）-（-）-柠檬烯氧化物（6.99%）。据报道，D-柠檬烯具有杀菌、抗氧化剂、化学预防和治疗活性[16]，除此之外，α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯氧化物等倍半萜烯也具有相似的生物活性，这可能是褚橙精油具有抑菌性的主要原因[17]。

2.3.2 褚橙精油及纳米乳的抑菌性 大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。变形杆菌也属于革兰氏阴性细菌，通常在食物中繁殖并产生可引起人中毒的毒素，而枯草芽孢杆菌在自然界广泛存在，属于革兰氏阳性细菌。作者研究了精油及乳液对这3种细菌的抗菌性能。

表1 褚橙精油的化学成分分析Table 1 Chemical composition of orange essential oil

如表2所示，褚橙精油纳米乳液对大肠杆菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果比纯精油好。这些结果与最近的其他研究一致，这些研究表明，精油转化为纳米乳液可以提高其抗菌活性[1，18]。造成这种现象的原因可能是乳液中的小脂质颗粒能够将精油带到细胞膜表面，而纯精油由于水溶性低而无法轻易与细胞膜相互作用[18]。

表2 褚橙精油及其纳米乳的抑菌效果Table 2 Antibacterial activities of orange oil and its nanoemulsion

3 结 语

本研究对褚橙精油纳米乳制备过程中的表面活性剂复配比、浓度以及乳化剪切速率进行了优化，以制备高质量的纳米乳液。结果显示，以Tween 80∶Span 80 质量比 1∶2、质量浓度为 3 g/dL、剪切速率为12 000 r/min时，褚橙精油纳米乳液表现出了最小粒径和最大的稳定性。单一表面活性剂和复配表面活性剂为乳化剂的乳液在24 h内表现出不同程度的不稳定性，褚橙精油纳米乳液的不稳定性主要是由严重的重力分离引起的，以复合表面活性剂为乳化剂制备的乳液稳定性最好。此外，相比较于纯精油，褚橙精油纳米乳液表现出更明显的抑菌效果。该研究为今后褚橙精油在食品或其他领域中的应用提供了依据和参考。