结合PRiME HLB净化快速测定动物源性食品中二硝托胺残留的超高效液相色谱-串联质谱法

庞李艳，钟名琴，吴雯娟*，黄 婷，谭 磊

（1.深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳 518000；2.广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518000）

二硝托胺，又名球痢灵，是20 世纪60 年代法国Dow 公司研发的一种化学合成类抗球虫药[1-2]。于1989 年在我国批准使用，主要作用于预防和治疗肉鸡和蛋鸡盲肠和小肠球虫病（产蛋期禁用）。因其高效、低毒、代谢速度快、抗药性小、性能稳定等特点被普遍使用[3]。二硝托胺可降低球虫卵囊检出率和肉鸡死亡率，增强免疫力，提高饲料转化率和生长性能等[4-5]。然而，长时间过高浓度使用反而会导致鸡生长速度缓慢、产蛋停止、共济失调、抑郁、饲料转化率低等症状，造成的药物残留也将导致环境和人体健康的潜在危害[6]。为保障动物源性食品的食用安全，国内外制定了相应的最大残留限量（MRLs）。日本和欧盟明确鸡肉中二硝托胺的 MRLs 为 0.1 μg·kg-1，我国农业部235 号公告对二硝托胺的MRLs 也作出了相应规定。目前，有关二硝托胺的检测方法主要有凯氏定氮法、薄层层析法、剩余量回滴法、分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法等[2,7-12]。其中HPLC-MS/MS法灵敏度高、选择性强，适用于复杂基质中二硝托胺残留的确证分析[13]。进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定液色谱-质谱法（SN_T 2453-2010）是动物组织中二硝托胺的唯一检测标准，该方法前处理复杂、检测效率低。肉类样品基质复杂，蛋白质、脂肪及磷脂等干扰物多[14]。Oasis PRiME HLB 是种增强型新型反相SPE 吸附剂，具有特殊设计的筛板、填料及生产工艺，能有效降低质谱分析中磷脂等非极性干扰物产生的基质效应，净化效果优于正己烷，且无需活化平衡[15-17]。其样品前处理过程简单、快速、方便，数据稳定可靠，还可延长色谱柱寿命、减少仪器维护成本。本研究基于Oasis PRiME HLB 一步式净化法，建立动物源性食品中二硝托胺残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Aglient 1290 超高效液相色谱仪（美国Aglient公司）；AB Sciex Triple QuadTM5500 质谱仪（美国AB Sciex 公司），配有电喷雾（ESI）离子源；NEVAP-112 型全自动氮吹仪（美国Organomation）；MTV-100 多管涡旋混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；梅特勒PL602E 型天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Sigma 3-18KS 离心机（德国Sigma）；一级水由Milli-Q Integral 3 型超纯水仪（法国Milli-Q）制取；奥特赛恩斯AS 系列超声波清洗机（奥特赛恩斯仪器有限公司）；Waters Oasis PRiME HLB（规格：6cc 200 mg）固相萃取柱（美国Waters公司）。

二硝托胺（Dinitolmide，CAS：148-01-6）标准物质为德国Dr.Ehrenstorfer 公司产品，其纯度高于97.0%。甲醇、乙腈、甲酸等有机试剂均色谱纯，购自德国Merck。

1.2 提取液的制备

准确量取乙腈800 mL，加入纯水200 mL 制得乙腈水溶液（80+20，V1+V2），再加入甲酸2 mL，超声10 min，得0.2%甲酸-乙腈水溶液（0.2+80+20，V1+V2+V3）。

1.3 标准储备液和标准工作液的配制

准确称取二硝托胺标准物质，用乙腈溶解并稀释成浓度为1.00 mg·mL-1的标准储备液，于4 ℃下避光保存，保存期为6个月。需要时，再准确移取适量标准储备液用乙腈逐级稀释成适当浓度的标准工作液，现配现用。

1.4 样品处理

1.4.1 提取

准确称取经充分绞碎且均质的新鲜鸡肉组织2.5 g（精确至0.01 g）于50.0 mL 离心管中，加入0.2%甲酸-乙腈水溶液10 mL，水平振荡器上涡旋振荡1 min后，超声提取5 min。于高速冷冻离心机8 000 r·min-1离心5 min，收集上清液。

1.4.2 净化

取4.0 mL 上清液以1 滴·s-1的流速直接过上述Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，并将全部流出液收集于干净的玻璃小管中。准确移取上述流出物2.5 mL于15 mL带刻度离心管中，40 ℃水浴下氮吹至液体体积少于0.5 mL，用甲酸-甲醇水溶液（甲酸：甲醇：水=0.09：10：90，V1：V2：V3）定容至1.0 mL，混匀。复溶液过0.22 μm 微孔滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 UPLC-MS/MS条件

1.5.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流动相A为纯水；流动相B为甲醇（色谱纯）；柱温40.0 ℃；进样体积5.0 μL。具体梯度洗脱程序见表1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃；雾化器压力：55.0 psi；辅助加热器压力：55.0 psi；气帘气压力：35.0 psi；碰撞气压力：9 psi。保留时间、定性/定量离子对、碰撞能量及去簇电压见表2。空白基质及空白基质中添加二硝托胺药物5.00 μg·kg-1的液相色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

表2 质谱参数

图1 空白基质及空白基质中添加5.00 μg·kg-1二硝托胺的色谱

2 结果与讨论

2.1 线性关系

在空白基质样品中分别加入2.50、5.00、25.0、50.0、250 μg·kg-1一系列浓度的空白添加试样，在上述优化后的实验条件下进行提取、净化和浓缩，待仪器稳定后依次进样分析，以目标物峰面积 A 为纵坐标、目标物浓度 X（μg·kg-1）为横坐标，制得基质加标工作曲线。二硝托胺在2.50～250 μg·kg-1范围内的线性关系良好，且相关系数R≥0.997。二硝托胺标准曲线的线性参数见表3。

由于电喷雾离子源（ESI）易受样品基质的影响，该方法通过空白基质加标制作工作曲线的方式可有效克服基质效应对测定结果准确性带来的影响，在一定程度上可消除试验过程中的系统误差。

2.2 方法检出限与定量限确定

采用在空白基质中做二硝托胺添加水平为5.00 μg·kg-1的 7 平行阳性添加试验，按照 1.4 方法进行前处理，上机测得二硝托胺的含量分别为4.734、 4.490、 4.270、 4.144、 4.569、 4.211 和4.289 μg·kg-1。计算得样本中二硝托胺含量的平均值 -X为4.39 μg·kg-1，标准偏差Sb为0.215。根据公式（LOD/LOQ）=（k×Sb×C）/-X（k为置信因子，一般检出限（LOD）取3，定量限（LOQ）取10；C 为添加浓度水平，μg·kg-1）计算得，LOD和LOQ分别为0.735和2.45 μg·kg-1，见表3。

2.3 方法回收率和精密度验证

在空白鸡肉样品中分别添加低、中、高3个不同水平的标准工作溶液，每个水平6个平行，在优化的实验条件下进行目标化合物的回收率试验，样液经超高效液相色谱-串联质谱仪测定。其回收率和相对标准偏差结果见表4。可见，该方法的回收率较高，5.00、10.0、50.0 μg·kg-1添加水平的回收率范围分别为82.8%～94.6%、87.1%～94.0%、90.0%～99.2%，均符合相关要求。而且该方法操作简单，检出限低、重复性好，结果准确可靠，峰形稳定，能满足残留分析的要求，适用于动物源性食品中二硝托胺的检测分析。

表3 标准曲线线性参数

表4 方法加标回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结 论

本方法以Oasis PRiME HLB固相萃取柱“上样-洗脱”2 步法净化，建立了动物源性食品中二硝托胺残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。结果显示，该方法操作简单、快捷，方法检出限低、回收率高、灵敏度好。能有效去除复杂肉类样品中蛋白质、油脂等引起的基质干扰，延长色谱柱的使用寿命，降低对质谱仪的污染，适用于动物源性食品中二硝托胺的准确定性、定量检测。