生长环境及培养基对小麦单倍体胚萌发率和成苗率的影响

吴晓军，胡喜贵，陈向东，姜小苓，胡铁柱，李笑慧，程 威，茹振钢

(河南科技学院 小麦中心/河南省杂交小麦重点实验室/现代生物育种河南省协同创新中心，河南 新乡 453003)

基于染色体消失法的小麦×玉米诱导单倍体技术，具有对可交配性基因Kr不敏感的优点，不同基因型小麦均能够获得单倍体植株[1]，是目前小麦单倍体的主要产生方式之一，已越来越多地应用于国内外小麦育种中[2-3]。

由于小麦与玉米的亲缘关系较远，杂交穗籽粒没有胚乳，导致单倍体幼胚的生长发育得不到正常营养供应，需要及时进行离体培养以保证其存活。影响小麦单倍体胚离体培养效果的因素较多。在小麦植株生长阶段，激素处理、环境因素、基因型及基因型对环境的适应性等均会影响单倍体胚的产生及生长发育状况[4-8]。其中，最主要的因素是适宜小麦植株及杂交穗生长发育的环境条件。在离体培养阶段，胚拯救的时机、培养基成分、培养环境条件等因素也会影响单倍体胚的成苗率[4-10]。其中，胚拯救的时机是影响成苗率最关键的因素，其次是支持未成熟胚继续生长发育直至成苗的培养基成分[11]。小麦单倍体胚离体培养多以MS、1/2MS或B5等为基础培养基，通过添加激素、蔗糖和其他营养成分形成不同类型的培养基，而且一般多为一次成苗培养基[3,12-13]。

不同基因型小麦与玉米杂交后均能获得单倍体胚，但得胚率差异较大。目前，关于单倍体育种技术研究主要集中于高效培养基的筛选、培养基成分改进、激素组成及配比分析等方面[3,12-13]。而对于培养基及生长环境对单倍体胚萌发及成苗的影响研究还未见报道。为此，以1/2MS培养基为基础培养基，通过添加谷氨酰胺、激素等进行培养基改进，并对来源于大田、盆栽和离体培养的小麦单倍体胚进行培养，明确培养基添加物质对不同环境来源小麦单倍体胚发育的促进作用，进而筛选出适合不同基因型小麦材料的通用型培养基，以稳定提高小麦单倍体胚的成苗率。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用小麦材料为由多个黄淮麦区小麦品种构建的矮败轮选群体不育单株(Rss1)，种植于新乡市河南科技学院小麦中心朗公庙镇试验基地，其中一部分种植于花盆内；2个单交组合F1百农4199×云南麦(C1F1)和百农4199×矮05(C2F1)，种植于花盆内，所有小麦材料均由河南科技学院小麦中心提供。父本材料为水果玉米甜脆蜜9号，购自北京金土地农业技术研究所，种植于日光温室内。

试验所用培养基为MC1、MC2、MC3。MC1：1/2MS(大量元素减半)+30 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH值5.8。MC2：1/2MS+50 mg/L维生素C+150 mg/L谷氨酰胺+20 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH值5.8。MC3：1/2MS+0.5 mg/L IAA(Indole-3-acetic acid)+0.5 mg/L KT(Kinetin)+150 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH值5.8。

离体培养液为1/2 MS(含大量和微量元素)+8 mL/L 亚硫酸+20 g/L蔗糖。

1.2 材料种植、杂交

Rss1种植于大田及花盆，C1F1、C2F1种植于花盆中，玉米分期种植于温室内。C1F1、C2F1使用常规方法去雄整穗，Rss1花药败育只需剪颖即可，整穗后及时套袋，挂上标签。采集新鲜玉米混合花粉在9:00—11:00对小麦进行授粉。Rss1授粉后继续生长于大田环境，选取其中15个杂交穗保留茎秆沿着地面剪掉，进行离体培养。生长于花盆内的Rss1、C1F1和C2F1授粉后继续在花盆中生长直至剪穗。授粉后24 h和48 h进行穗部激素处理，处理液为2，4-D(100 mg/L)和二甲基亚砜(20 mL/L)的混合溶液，喷施处理需确保每个小穗雌蕊都能接触到激素溶液。

离体培养具体步骤：选取生长于大田的15穗Rss1,在授粉24 h后割穗并立即进行第1次激素喷穗处理，放入离体培养液中，在人工培养箱内进行离体培养(16 h光照，湿度75%)，授粉48 h后进行第2次激素喷施，以后每3 d更换1次离体培养液。

1.3 试验设计

在授粉后16 d，取大田、盆栽杂交穗，在超净工作台上用75%乙醇进行籽粒表面灭菌1 min，无菌水冲洗1～2次，接着用0.1%升汞溶液灭菌10 min，无菌水冲洗4～5次，每次20 s，同时不停搅拌。在解剖镜下剥出幼胚，接种于培养基上。接种后培养基先在4 ℃冰箱中处理2～3 d，然后置于组织培养室23 ℃黑暗条件下培养3 d，再置于23 ℃、16 h/d光照条件下培养至出苗。在授粉后15 d，取15个Rss1离体培养杂交穗，在超净工作台上进行剥胚和接种操作(方法同上)。

将大田、盆栽及离体培养Rss1获得的单倍体胚接种于MC1培养基上，每个处理3次重复，分析不同环境来源小麦单倍体胚的培养效果。将大田(Rss1)和盆栽(C1F1和C2F1)小麦材料获得的单倍体胚分别接种于MC1、MC2和MC3培养基上，每个处理3次重复，分析不同培养基对小麦单倍体胚萌发及成苗的影响。

接种15～25 d后统计萌发数、成苗数，计算萌发率、成苗率。统计成苗数时设定统计标准：至少明显有1～2片叶、植株高2～3 cm以上且至少长出1条根。

得胚率=接种胚数/授粉小花数×100%;

萌发率=萌发胚数/接种胚数×100%;

成苗率=成苗数/接种胚数×100%。

1.4 数据处理

使用DPS 7.05软件进行数据处理，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同环境来源小麦单倍体胚在MC1培养基上的培养效果

小麦×玉米的杂交穗经离体培养一般13～16 d可剥胚，绝大部分籽粒饱满且持绿正常，中大胚率较高，胚形态较完整。大田生长的杂交穗一般需要生长16 d以上可剥胚，衰枯籽粒较多，占40%以上，中大胚率较离体培养低，且大胚易出现畸形和完整度低的现象。盆栽杂交穗一般也需要生长16 d以上可剥胚，衰枯籽粒占30%以上，中小胚较多，大胚较少。大田生长、盆栽和离体培养结果(表1)显示，Rss1杂交穗在大田中生长，得胚率仅为2.2%；盆栽得胚率为5.3%；而杂交穗离体培养的得胚率达到8.4%，几乎是大田条件下的4倍，且接种到MC1培养基上，单倍体胚的萌发率和成苗率分别为81.5%和63.0%，比大田条件下提高60.1%和3.4倍，比盆栽高出30.4%和68.0%。表明提供适宜的生长环境，获得发育程度适宜的幼胚是提高单倍体胚萌发率和成苗率的关键。

表1 不同环境来源小麦单倍体胚的培养效果Tab.1 Culture effect of wheat haploid embryos from different environments

注：同列数据后不同大、小写字母表示不同材料间差异极显著(P<0.01)、显著(P<0.05),下同。
Note:The different uppercase,lowercase letters after data within a column mean significant differences among different treatments at 0.01,0.05 levels,respectively;the same below.

2.2 不同培养基对小麦单倍体胚萌发及成苗的影响

由表2可以看出，在MC1培养基中，小麦单倍体胚萌发率表现为Rss1>C2F1>C1F1，其中，Rss1高达50.9%，C1F1仅为16.7%；成苗率表现为C2F1>Rss1>C1F1，其中，C2F1高达27.8%，C1F1仅为8.3%。在MC2培养基中，小麦单倍体胚萌发率表现为Rss1>C1F1>C2F1，其中，Rss1高达62.2%，C2F1仅为25.0%；成苗率表现为Rss1>C1F1>C2F1，其中，Rss1高达32.4%，C2F1仅为16.7%。在MC3培养基中，小麦单倍体胚萌发率表现为C2F1>C1F1>Rss1，其中，C2F1高达85.2%，Rss1仅为53.8%；成苗率表现为C1F1>C2F1>Rss1，其中，C1F1高达80.8%，Rss1仅为25.6%。

由表2可以看出，共接种小麦单倍体胚418个，萌发211个，平均萌发率50.5%，成苗105株，平均成苗率25.1%。不同培养基上小麦单倍体胚的平均萌发率表现为MC3>MC2>MC1，MC1培养基与MC2培养基差异不显著，MC3培养基与MC1、MC2培养基间差异均达到极显著水平；平均成苗率表现为MC3>MC2>MC1，MC2培养基与MC1培养基间差异显著，MC3培养基与MC2、MC1培养基间差异均极显著。MC1培养基的平均萌发率(42.3%)和平均成苗率(15.3%)均最低，MC3培养基平均萌发率(65.6%)和平均成苗率(38.2%)均最高。

表2 不同培养基上小麦单倍体胚的萌发和成苗情况Tab.2 Embryo germination and plantlet regeneration on three different media

注：同列小计数据之间单独进行差异显著性比较。
Note:The significances of difference of subtotal data were compared separately.

不同培养基上的小麦单倍体幼苗的生长情况如图1所示，在不添加激素的MC1培养基上，小麦单倍体胚萌发时间一般为7～10 d，能够一次培养成苗，但平均萌发率和平均成苗率均最低。在添加了150 mg/L谷氨酰胺和50 mg/L维生素C的MC2培养基上，小麦单倍体胚经过近1个月培养，产生了质量较高的愈伤组织，能够直接分化出丛生苗，根系健壮，长势好。在添加激素(0.5 mg/L IAA和0.5 mg/L KT)和150 mg/L谷氨酰胺的MC3培养基上，小麦单倍体胚萌发时间一般为7～15 d，较MC1培养基晚，较MC2培养基早；培养3 d后单倍体胚小幅膨大，在未形成愈伤前直接分化出苗，幼苗生长速度快，但一般较细弱，根也较细短或无根，大部分无法一次培养成苗，需转移至添加多效唑的1/2MS培养基中进行促根壮苗培养。

A为MC1培养基，B为MC2培养基，C为MC3培养基A is MC1 medium，B is MC2 medium，C is MC3 medium图1 不同培养基上的小麦单倍体幼胚成苗情况Fig.1 Seedlings regeneration of wheat haploid immature embryos on different media

在本试验中，由于大田环境不利气候的影响，Rss1的单倍体胚发育状况普遍较差，畸形胚和小胚较多，影响了其在培养基中的培养效果，在MC2培养基上的培养效果最好，其次是MC3培养基，在MC1培养基上的培养效果较差。2个小麦组合C1F1和C2F1在盆栽营养供应不充裕的情况下，获得的多为中小胚和发育不良幼胚，其在添加激素和营养物质的MC3培养基上的培养效果最好。综合以上结果，在单倍体幼胚发育状况不佳的情况下，添加营养物质或激素的1/2MS培养基能够获得相对于1/2MS培养基更好的培养效果。

2.3 不同小麦材料的单倍体胚萌发及成苗情况

不同小麦材料的平均萌发率和平均成苗率如表3所示，萌发率以小麦组合C2F1最高，达到54.0%；Rss1次之，为53.7%；C1F1最低，为40.4%。成苗率以C1F1最高，达到32.7%；C2F1次之，为26.4%；Rss1最低，为21.1%。综合来看，小麦组合C1F1的成苗率最高，Rss1最低。

表3 不同小麦材料单倍体胚的萌发和成苗差异Tab.3 Diversity of embryo germination and plantlet regeneration frequency in different wheat materials

3 结论与讨论

在云南省昆明市自然条件下小麦材料播期为3月下旬到8月上旬，花期为5月上旬到10月上旬，期间均可以与大田玉米的花期相遇[7]，得天独厚的地理环境及气候为小麦单倍体技术的低成本全年大规模利用创造了条件。而在黄淮及华北地区，大田条件下小麦的适宜授粉时间约为1个月，一般在4—5月[8,13]。因此，在自然条件下这些地区的单倍体育种利用受到限制，需要提供其他设施条件以延长授粉时间，人力物力成本相对较高，不利于该地区单倍体育种技术的规模化发展。

研究表明，小麦单倍体胚诱导的最佳温度为白天22 ℃、夜晚17 ℃[13]；在云南省昆明市自然条件下，授粉后进行浇灌能够提高小麦单倍体胚诱导率，并且小麦结实饱满[7]。河南科技学院小麦中心品种创新课题组连续多年的小麦单倍体育种实践表明，在河南省新乡市大田条件下进行小麦×玉米远缘杂交诱导小麦单倍体胚的效率非常低，一般得胚率只有1%～3%，究其原因主要是近年来极端天气频发和普通年份高温少雨导致的。众多学者对小麦杂交穗易遭受复杂多变环境因素影响的问题进行了深入研究，提出采用杂交穗离体培养的方法来避免环境干扰，近年来也获得了较大的研究进展[8,14-16]。顾坚等[16]在云南昆明进行的杂交穗离体培养得胚率一般是田间自然生长的3倍以上，本研究也得出类似结果。本研究发现，在大田生长的小麦植株相比于温室和盆栽分蘖更多且更加健壮，在花期与玉米授粉后割取杂交穗进行离体培养，一般12～16 d就可以剥取单倍体幼胚，时间短，人力投入集中，是一种在该地区较为经济、高效和易于规模化的单倍体育种方式。

小麦单倍体胚培养一般以B5和MS及其衍生培养基为基础培养基[8,17]。本研究发现，与添加了谷氨酰胺和维生素C的MC2培养基相比，未添加其他成分的MC1培养基中小麦单倍体胚的平均萌发率无显著差异，而平均成苗率显著降低；与添加了IAA和KT的 MC3培养基相比，未添加其他成分的MC1培养基中小麦单倍体胚的平均萌发率和成苗率均极显著降低。目前，关于添加激素对小麦单倍体胚萌发和成苗的影响研究结论不一。陈新民等[8,18]研究表明，1/2MS培养基中小麦单倍体胚成苗率显著高于Taira-Larter(TL)培养基，B5培养基与1/2MS培养基的培养效果差异不明显，一次培养成苗率均较高，能够达到70%～80%；并且认为1/2MS培养基加入一定浓度的激素IAA和KT也能够达到较好的培养效果，这与本研究结果类似。然而，来长凯[19]研究表明，1/2MS培养基中小麦单倍体胚萌发率能够达到86.5%，略高于添加了激素成分的1/2MS培养基，成苗率显著高于添加激素的培养基，这与本研究结果相反。蔡东明[20]在1/2MS培养基中添加激素成分，结果显示，小麦单倍体幼胚萌发率达到了92.2%，而1/2MS培养基上小麦单倍体幼胚并未萌发。赵翠荣等[21]认为，在培养基中添加适宜浓度的激素能够促进一些发育状况不佳幼胚的发育，但却抑制发育成型幼胚的萌发和生长。造成这种差异的原因可能有以下2个方面：一是小麦材料的遗传背景差异会影响单倍体胚诱导形成和分化能力，造成一些小麦材料单倍体胚的诱导或培养效果不理想，或者只在特定培养基上才具有较好的培养效果；二是接种时的单倍体胚发育状况不同，如在田间条件下杂交穗受到不利天气影响造成单倍体胚的发育缓慢、畸形，杂交穗的上部穗位会产生相当数量的小胚等，这些胚在未添加激素的1/2MS培养基上难以分化，易产生玻璃化苗，培养效果不理想，而在添加代谢途径重要物质或激素成分的培养基上，能够继续生长完善，从而提高分化能力。在本研究中，小麦材料Rss1种植于大田环境中，由于该地区的高温少雨天气非常不利于单倍体胚诱导形成和生长，造成了一方面杂交穗的结实率较低(60%～70%)，另一方面获得的发育不良的单倍体胚较多，因此,在不添加激素和其他营养成分的1/2MS培养基上的培养效果较差，而在其他2种培养基上能够获得相对更好的培养效果。2个盆栽杂交组合F1，在遭遇高温或低温天气时可以随时搬入智能温室躲避，畸形胚较少，但受限于植株营养供应不足，获得的胚一般都较小，在1/2MS培养基上的培养效果也较一般。小麦杂交组合C2F1对培养基具有选择性,在MC2培养基上的培养效果反而不如MC1培养基。综合来看，加入激素和营养物质的MC3培养基对不同小麦基因型材料都具有较好的培养效果，能够促进发育状况不佳单倍体幼胚的生长和分化，但一次培养成苗率较低，需要在出苗后及时更换培养基，进行促根壮苗培养。

本研究结果表明，添加其他营养物质、激素成分的1/2MS培养基能够促进小胚和发育不良幼胚的生长和分化，提高萌发率和成苗率。在进行单倍体育种实践时，可根据对当年获得总胚数和幼胚质量的预测，提前制备一定比例的1/2MS通用培养基和MC3培养基，以满足不同质量单倍体幼胚的培养要求，提高成苗率。下一步将继续研究小麦材料生长和杂交穗发育的适宜环境条件，优化适宜该地区的单倍体育种方法。