刘 晔
(福建林业职业技术学院,福建 南平 353000)
糯玉米芯作为主要粮食作物玉米的一种加工废弃物,多用于造纸制浆和家畜饲喂[1],综合开发利用率不高,经研究发现,玉米芯内含有多种生物活性成分,可作为木糖、黄酮、多酚类物质等高附加值产物的原料[2]。黄酮类化合物作为玉米芯中的主要活性物质之一,具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化等药理作用[3]。热回流提取法、超声波提取法、微波提取法等仍然为黄酮类物质最主要的提取方法[4],但上述方法操作复杂、成本高、易破坏有效成分、不易于连续生产。而双水相作为一种聚合物-盐-水萃取体系具有萃取条件温和,不破坏生物活性,易于连续生产等特点,已被应用于分离色素,生物碱,黄酮以及小分子化合物[5]。本实验通过PEG1000-(NH4)2SO4双水相对糯玉米芯中黄酮进行萃取,探讨其最佳工艺条件,并评价其抗氧化能力,旨在为分离玉米芯黄酮提供新途径。
糯玉米芯采集于南平市郊区;芦丁标准品,江西佰草源生物科技有限公司;Tris,Scientific Phygene;PEG1000、水杨酸 、乙 醇 、(NH4)2SO4、NaCl、NaOH、盐 酸 、Al(NO3)3、NaNO2、L-抗坏血酸、FeSO4、邻苯三酚、30%H2O2,西陇化工股份有限公司。
UV-1600紫外可见分光光度计,翱艺仪器有限公司;KQ-500E超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;ST2100 pH计,奥豪斯仪器有限公司。
1.3.1 玉米芯黄酮粗提液制备
将糯玉米芯干燥至恒定质量,粉碎过筛备用。称取糯玉米芯样品粉末2.5 g,75%乙醇作为浸提液,超声提取30 min,离心,得上清液。
1.3.2 绘制芦丁标准曲线
芦丁标准溶液配制成一定浓度,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[6],于510 nm波长处测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度值,绘制标准曲线。
1.3.3 制备双水相体系相图
采用浊点法[7],将PEG1000溶液置于比色管中,加入一定浓度的(NH4)2SO4溶液混合,直至体系有两相产生,计算此时二者的质量分数,加水破坏两相,重复上述步骤,将数据整合进行相图绘制。
1.3.4 单因素试验设计
将2 mL黄酮粗提液混合在双水相萃取体系中,分别设置总体系中PEG1000质量分数(18%、20%、22%、24%、26%、28%),(NH4)2SO4质量分数 (10%、12%、14%、16%、18%、20%),NaCl添加量(1%、2%、3%、4%、5%),pH 值(2、3、4、5、6、7),恒定体系总质量 10 g,将混合液 3 000 r/min 离心10 min,静置分层[8],考察这4项因素对玉米芯黄酮在双水相体系中的萃取效用。
式中:M——相比;V上、V下——上、下相体积,mL;K——分配系数;C上、C下——上、下相黄酮浓度,mg/mL。
1.3.5 正交优化筛选
单因素试验结果分析,以玉米芯黄酮萃取率为指标结果,将 PEG1000 质量分数、NaCl添加量、(NH4)2SO4质量分数、pH值为自变量,进行L9(34)正交试验,筛选出玉米芯黄酮最佳萃取工艺参数。
1.3.6 测定抗氧化活性
(1)羟自由基清除作用。参照李小红等[9]方法,以L-抗坏血酸为阳性对照,取浓度分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 的玉米芯黄酮提取液2 mL,与蒸馏水2 mL、2.5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、5 mmol/L FeSO4溶液各1 mL混匀,静置10 min;随即显色反应30 min,在510 nm处测定吸光度。
式中:B0——空白对照吸光度;B1——样品溶液本底吸光度;B2——样品吸光度。
(2)超氧阴离子自由基清除作用。参照单科开等[10]方法,将一定浓度的玉米芯黄酮样品溶液,运用邻苯三酚溶液自氧化法,于325 nm处每隔30 s测定一次吸光度。以L-抗坏血酸为阳性对照,试剂参比为0.01 mol/LHCl溶液。
式中:V1——样品所测吸光度值与时间的线性回归直线斜率;V0——蒸馏水所测吸光度值与时间的线性回归直线斜率。
测定0.008~0.056 mg/mL芦丁标准溶液的吸光度,回归方程为:y=11.546x+0.0008,R2=0.999 4。
作为影响两相平衡的主要因素,PEG1000与(NH4)2SO4二者的质量分数数值需位于临界线上方,才能够获得稳定的双水相体系。观察图1曲线,当PEG1000质量分数越大时,(NH4)2SO4含量不宜过低,否则不易形成两相,当PEG1000质量分数为18%时,(NH4)2SO4所需量应高于10%才易形成两相。因此,需选取临界曲线上方适宜的数值才能构建稳定的双水相体系。
2.3.1 PEG1000质量分数对玉米芯黄酮萃取率的影响
固定萃取体系中(NH4)2SO4质量分数18%,pH值 4,NaCl添加量3%,玉米芯黄酮在PEG1000质量分数为18%~28%范围时的体系中,研究分配系数和萃取率的分配趋势。由图2可知,PEG1000质量分数的增加,增强了两相之间相比,促使玉米芯黄酮富集于上相,提升了上相中黄酮的浓度,分配系数值也发生相应的增加。当PEG1000质量分数超过26%时,体系黏度升高[11],造成分配系数与萃取率数值降低。因此,体系中PEG1000质量分数在26%时,萃取效果最好。
2.3.2 (NH4)2SO4质量分数对玉米芯黄酮萃取率的影响
玉米芯黄酮在两相间的分配特性也取决于(NH4)2SO4质量分数。图3表明,当其质量分数不高于18%时,萃取率随浓度增加并达到最高值;在18%~20%范围内,随浓度增加而减小。在双水相体系中,(NH4)2SO4质量分数进一步增加,促使体系极性增强[12],受此作用使上相中黄酮浓度降低,导致萃取率随之下降。故体系中,设置(NH4)2SO4质量分数为18%,萃取效果显著。
2.3.3 NaCl添加量对玉米芯黄酮萃取率的影响
研究NaCl添加量在1%、2%、3%、4%、5%范围内,玉米芯黄酮在两相间的分配情况。由图4可知,NaCl添加量低于3%时,电解质离子在两相间的分配导致两相间电位差增大[13],有利于玉米芯黄酮萃取率的提高;当NaCl添加量超过3%时,双水相体系极性增强,阻碍黄酮进入上相,导致体系中玉米芯黄酮分配系数与萃取率下降。因此NaCl添加量3%为宜。
2.3.4 pH值对玉米芯黄酮提取率的影响
图5所知,由于pH增大,能引起双水相体系黄酮电荷性质和电位差的改变[14],影响玉米芯黄酮在上下相中的分配,从而导致玉米芯黄酮分配系数和萃取率随着体系pH值先增加后减小。根据总体趋势,pH值调整为4时最为适宜。
依据单因素试验结果,优化双水相萃取体系,将PEG1000质量分数(A)、(NH4)2SO4质量分数(B)、pH 值(C)、NaCl添加量(D)这四项因素进行L9(34)正交试验,从表1可知,影响玉米芯黄酮萃取率各因素的主次顺序为:ABCD,其最优工艺参数:A2B2C2D2,即PEG1000质量分数26%,(NH4)2SO4质量分数18%,pH为4,NaCl添加量3%。进行方差分析可知,PEG1000质量分数对黄酮萃取率具有显著性影响(p0.05)。在该条件下进行验证试验,试验平行3次,可得萃取率平均值为97.39%±0.26%。
表1 正交试验结果及分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal test
表2 方差分析表Tab.2 Analysis results of variance
2.5.1 羟自由基清除作用
玉米芯黄酮对羟自由基清除率,见图6。
图6 所示,随玉米芯黄酮浓度增加,对羟自由基清除效果呈直线上升趋势,当玉米芯黄酮、L-抗坏血酸浓度为0.6mg/mL时,对羟自由基清除率分别为70.28%和86.90%,二者之间有轻微差异。
2.5.2 超氧阴离子自由基清除作用
图7表明,玉米芯黄酮浓度的增加,对超氧阴离子自由基清除效果呈总体提升趋势。当玉米芯黄酮、L-抗坏血酸浓度为0.5 mg/mL时,清除率分别为67.94%和86.05%,其清除能力低于相同浓度的L-抗坏血酸。
通过正交实验优化PEG1000-(NH4)2SO4双水相体系萃取玉米芯中黄酮工艺,确定PEG1000质量分数为26%,(NH4)2SO4质量分数为18%,pH值为4,NaCl添加量为3%为最优工艺参数。在此工艺参数下,其萃取率可达97.39%±0.26%,优于传统的超声波浸提法,可作为一种更高效、稳定的提取方法。同时,对羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力上,主要取决于玉米芯黄酮的浓度,随添加量呈直线上升趋势。这为进一步综合开发利用玉米高附加值产物提供了一定的理论参考。