普萘洛尔抑制前列腺癌发展的分子机制

王仕钦，江春，黄卫，黄辉虎

(1.海南省中医院外二科，海口 570203；2.中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科，广州 510120)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康[1]。目前前列腺癌常用化学治疗(化疗)药物有多柔比星[2]和紫杉醇[3]等，但患者对现有化疗药物产生的耐药性严重限制化疗的疗效，因此亟待寻找针对前列腺癌新的化疗药物。普萘洛尔(propranolol)是一种治疗心律失常的药物，近年来发现普萘洛尔也能够对新生儿血管瘤[4]、前列腺癌[5]、新生儿面部横纹肌瘤[6]和乳腺癌[7]等癌症具有一定效果。BROHEE等[8]发现普萘洛尔能够通过控制糖代谢抑制前列腺癌的发展，除此之外，普萘洛尔也能够明显降低前列腺癌的发病风险[9]，但目前尚不明确其具体机制。小分子核糖核苷酸(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，在肿瘤发病过程中具有重要作用[10]，是一种治疗肿瘤的理想药物[11]。LU等[10]报道普萘洛尔能够靶向下调miR-1的表达水平。miR-382是一种抑癌因子，对食管鳞状细胞癌[12]、前列腺癌[13]和非小细胞肺癌[14]等癌症的发展具有调控作用。此外，普萘洛尔能够上调新生儿血管瘤细胞内miR-382的表达水平，抑制新生儿血管瘤细胞的发生和转移[15]，同时，miR-382对PC细胞的增殖和迁移能力具有抑制作用[13]。SETD8是一种甲基转移酶，能够使p53信号通路失活[16]。CHEN等[14]报道miR-382能够通过靶向下调SETD8的表达，抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的发生。VESCHI等[17]报道SETD8能够通过p53信号通路，促进神经母细胞瘤的凋亡。笔者前期研究发现，miR-382和SETD8在前列腺癌组织和细胞内表达水平呈负相关，并且普萘洛尔对其表达水平具有调控作用。笔者通过研究，推测普萘洛尔通过miR-382/SETD8/p53分子轴抑制前列腺癌的发展，为临床治疗前列腺癌提供新的思路。报道如下。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取2017年1—5月在中山大学孙逸仙纪念医院进行手术前列腺癌患者18例，TNM 分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期12例。年龄45～78岁，平均年龄(56.3±5.4)岁。留取其前列腺癌组织及对应的癌旁组织，-80 ℃冰箱冷冻保存备用。所有患者术前均未接受放化疗，均签署知情同意书。

1.2细胞系 人前列腺癌细胞系(LNCaP和PC3)和人源胚胎肾细胞(HEK-293T)均购自中国科学院上海细胞库，RWPE-1细胞购自ATCC细胞库，分别用标准条件下培养细胞，待密度达80%时，收集细胞备用。

1.3实验动物 雄性NIH小鼠，体质量18～22 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002，饲养于无特定病原体(SPF)级实验动物环境中。

1.4主要试剂 胎牛血清(批号：16000-044，Gibco，San Diego，CA，USA)，DMEM培养液(批号：C11885500BT，Gibco，San Diego，CA，USA)，0.25%胰酶(批号：25200056，Thermo Fisher Scientific，USA)，TRIzol试剂(批号：15596026，Invitrogen，USA)，LipofectaminTM2000(批号：11660-027，Invitrogen，USA)。荧光基因报告载体pGL3-Luciferase Reporter由Ambion公司设计并合成，内参载体pRL-TK和双荧光素酶报告检测试剂(批号：E1910，Promega Corporation，USA)均购自Promega公司，兔抗人SETD8(批号：ab3798)、N-钙黏蛋白(N-cad，批号：ab18203)、E-钙黏蛋白(E-cad，批号：ab1416)、波形蛋白(Vimentin，批号：ab193555)、Bcl-2(批号：ab185002)、Bax(批号：ab32503)、Caspase 9(批号：ab219590)、p53(批号：ab32389)和p21(批号：ab218311) 抗体均购自美国Abcam公司；miR-382Mimic、miR-382 inhibitor和miR-382 control由上海吉玛基因公司设计合成，CCK-8细胞增殖及毒性试剂盒(批号：CA1210，Solarbio)。

1.5仪器 多功能酶标仪(SynergyTM2)购自BioTek公司，荧光定量PCR仪(Light-Cycler 480Ⅱ)购自Roche公司，化学发光仪(BDMAX)购自BD公司，Olympus1×51倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.6qRT-PCR检测前列腺癌和癌旁组织中miR-382和SETD8 mRNA的表达 患者前列腺癌和癌旁组织标本各取约100 mg，加入1 mL Trizol，用PRO-200组织匀浆机(Pro Scientific，USA)充分破碎后，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。抽提总RNA测定浓度及纯度后，设计并合成miR-382逆转录引物：正向5′-ACACTCCAGCTGGGGAAGTTGTTCGTGGTG-3′，反向：5′-CGAATC CCTCAACTGGTGC-3′。SETD8 mRNA的逆转录引物为：正向5′-TCAGGCCTCA AAGCCACCTGAT-3′，反向5′-TAGGCCATCCAACC-TGCATTACCG-3′。U6的逆转录引物为：正向 5′-CTCGCTTCGCAGCACA-3′，反向 3′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，置于-80 ℃冰箱冷冻保存备用。以β-actin作为内参，qRT-PCR引物见表1。用ABI PRISM 7500型荧光定量PCR扩增仪(Thermo fisher Scientific，USA)检测miR-382和SETD8 mRNA表达水平，Real-Time PCR反应体系及条件：2×SYBR Premix 10 μL，ddH2O 0.8 μL，cDNA1 μL，PCR上游和下游引物各0.5 μL，95 ℃预变性30 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。将miR-382和SETD8 mRNA表达量分别与内参U6和β-actin表达量的比值作为其相对表达水平，每个样本设3个复孔，实验重复3次。

表1 qPCR引物序列

1.7Western blotting检测蛋白表达水平 根据蛋白提取试剂盒说明书提取组织或细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶电泳分离目的蛋白，湿转法将分离后的蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸入5%脱脂奶粉中，摇床上室温封闭2 h。洗膜后加入一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔二抗(1：10 000)，室温振荡孵育1 h。按照A液：B液(1：1)配制电致化学发光(ECL)发光液，混匀放置1 min后均匀加在膜正面。利用凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)观察蛋白条带，采用Image J软件进行灰度分析，实验重复3次。

1.8CCK-8检测前列腺癌细胞增殖能力 根据预实验将0.01 mg·mL-1普萘洛尔与PC细胞系LNCaP和PC3在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)条件下共培养0，12，24，36和48 h，向每孔加入CCK-8液10 μL，继续孵育4 h后进行检测。SynergyTM2多功能酶标仪在波长450 nm处检测各孔吸光度值(A值)，以A值代表细胞相对增殖水平，绘制细胞增殖曲线。

1.9小鼠动物模型的构建 将前列腺癌细胞系LNCaP和PC3在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中传代培养，待单细胞生长密度达到60%～80%时，用0.25%胰酶消化，收集细胞并将细胞浓度调整至1×105·mL-1，每只NIH小鼠皮下注射200 μL，共30只小鼠，在相同饲养条件下饲养10～14 d，建立前列腺癌动物模型。向每只小鼠肿瘤原位注射0.01 mg·mL-1普萘洛尔和磷酸盐缓冲液(PBS)100 μL，分为对照组(PBS)、普萘洛尔组，普萘洛尔+miR-382抑制剂组，每日观察小鼠，并记录小鼠死亡时间。

1.10瞬时超表达/敲降miR-382前列腺癌细胞系的构建 将处于对数生长期LNCaP和PC3细胞分别接种于6孔板中，每孔细胞2×106个，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞融合度达70%～80%时进行转染。分为转染试剂对照组、阴性对照组(NC)、miR-382 Mimic组和miR-382 Inhibitor组，miR-382 Mimic和Inhibitor终浓度为80 nmol·L-1。按照说明书将各组转染物与LipofectamineTM2000混合后转染细胞48 h之后，采用qRT-PCR鉴定转染是否成功。

1.11双荧光素酶报告基因法检测miR-382转染293T细胞后SETD8 3’-UTR的报告基因活性 生物信息学方法预测SETD8基因上miR-382靶向位点，以PC3细胞的cDNA为模板，设计引物扩增出野生型SETD8 3’-UTR序列，并以3’-UTR野生型载体为模板构建突变型SETD8(mu)3’-UTR报告载体。实验分组为：空白对照组(转染报告载体pGL3-Luciferase空载体、内参载体pRL-TK和Ctrl-Mimic)；阴性对照组(转染报告载体pGL3-Luciferase空载体、内参载体pRL-TK和miR-382 Mimic)；实验组[转染SETD8 3’-UTR或SETD8(mu)3’-UTR报告载体、内参载体pRL-TK和Ctrl-Mimic或miR-382 Mimic]。将293T细胞制成细胞悬液，接种至96孔板，每孔3 000个细胞，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。待细胞密度达到约50%时进行转染，按照说明书将各组转染物与LipofectamineTM2000混合后转染细胞，48 h后加入PLB裂解液室温裂解15 min，采用双荧光素酶报告基因法上机检测，以Firefly与TK Renilla荧光活性的比值作为报告基因活性值，实验重复3次。

1.12Transwell侵袭实验检测前列腺癌细胞迁移能力 Transwell小室内膜预先用Matrigel胶包被，实验开始前向每个小室内加入含10 g·L-1BSA的无血清培养基50 μL，37 ℃孵育30 min，水化基底膜。分别将LNCaP和PC3细胞胰酶消化后计数，分为对照组、超表达miR-382组(miR-382 Mimic)和同时超表达miR-382和SETD8组(382-Mimic+SETD8)，用无血清培养基调整细胞浓度为5×105·mL-1，向上层小室内加入细胞悬液200 μL，小室下层加入含10%胎牛血清的完全培养基400 μL。培养24 h后弃去培养基，用PBS洗2次，使用棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞。4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗2次，结晶紫染色30 min后，再用PBS洗2次。倒置显微镜下计数转移至微孔膜下层的细胞(选取5个视野)，每组设置3个重复孔。

2 结果

2.1miR-382和SETD8 mRNA在前列腺癌组织和细胞内的表达差异 Real-Time qPCR检测结果表明，miR-382在前列腺癌组织内的表达水平显著低于癌旁正常组织[(0.398±0.012)比(0.882±0.023)，P=0.031]，而SETD8在前列腺癌组织内的表达水平则明显高于癌旁正常组织[(2.83±0.141)比(1.526±0.083)，P=0.002]。细胞实验结果见图1。与人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1比较，miR-382在前列腺癌细胞系LNCaP和PC3内的表达水平明显下调(P=0.003，0.001)，而SETD8的表达水平则明显上调(P=0.014，0.008)。表明miR-382在前列腺癌组织和细胞内低表达，而SETD8高表达，两者表达水平呈负相关。

2.2普萘洛尔调控前列腺癌细胞内miR-382、SETD8和p53的表达 Real-Time qPCR结果见图2，与对照组(0 h)比较，随着共培养时间的延长，普萘洛尔明显提高miR-382在PC细胞系内的表达水平(P<0.01)，抑制SETD8 mRNA的表达(P<0.01或P<0.05)。Western blotting结果见图3。与对照组(0 h)相比，共培养12，24，36和48 h后，普萘洛尔能够明显降低前列腺癌细胞系内SETD8蛋白的表达水平(P=0.005，0.003，0.002，0.012)，并提高p53蛋白的表达水平(P=0.043，0.021，0.008，0.004)。表明普萘洛尔能够上调前列腺细胞系内miR-382和p53的表达水平，抑制SETD8的表达，并且随着共培养时间的延长，普萘洛尔的作用越明显。

①与正常组织比较，P<0.01。

①Compared with normal tissue，P<0.01.

2.3前列腺癌细胞增殖抑制结果 将普萘洛尔与前列腺癌细胞共培养12，24，36和48 h，CCK-8检测细胞增殖能力结果见图4。与对照组比较，共培养48 h，普萘洛尔能够明显抑制两株前列腺癌细胞的增殖能力(P=0.053，0.048)，共培养时间越长，效果越明显。实验结果表明，与普萘洛尔单独组比较，普萘洛尔和miR-382抑制剂同时共培养能够使前列腺癌细胞的增殖能力得到部分恢复，差异有统计学意义(P=0.015，0.017)。分别采用前列腺癌细胞系建立小鼠肿瘤模型，与对照组比较，肿瘤内单独注射普萘洛尔能够明显延长小鼠的存活时间(P=0.025，0.013)，同时注射miR-382抑制剂则部分延长小鼠的存活时间(P=0.036，0.032)(图5)。以上结果表明，普萘洛尔通过miR-382抑制前列腺癌细胞的增殖。

①与0 h比较，P<0.05。

①Compared with 0 h，P<0.05.

2.4miR-382通过SETD8调控p53/p21信号通路 Western blotting结果见图6，与对照组比较，miR-382 Mimic能够明显降低前列腺癌细胞系LNCaP和PC3内SETD8的表达水平[(0.286±0.016)和(0.493±0.028)比(0.963±0.083)和(1.112±0.321)，P=0.008，0.013]，而miR-382抑制剂对SETD8表达水平无明显影响[(0.963±0.083)和(1.112±0.321)比(1.064±0.201)和(1.031±0.032)，P=0.241，0.883]。双荧光素酶报告基因检测结果显示(图7)，miR-382能够靶向抑制SETD8的表达水平。为了进一步探究miR-382是否通过SETD8调控p53信号通路，在前列腺癌细胞系内超表达SETD8或采用miR-382 Mimic转染细胞，Western blotting结果表明(图8)，与对照组比较，超表达SETD8能够明显降低前列腺癌细胞系内p53和p21的表达水平(P=0.008，0.024；P=0.013，0.041)，miR-382 Mimic明显提高p53和p21的表达水平(P=0.001 2，0.006 3；P=0.004，0.021)。回复实验表明，与单独超表达SETD8组比较，同时采用miR-382 Mimic转染细胞能够回复p53和p21的表达水平(P=0.013，0.037；P=0.043，0.008)。以上结果提示，miR-382通过靶向调控SETD8，提高p53信号通路的活性。

图5 3组小鼠存活时间

①与对照组比较，P<0.01。

图6 Western blotting法检测前列腺癌细胞系LNCaP和PC3内SETD8表达水平

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.6 The expression levels of SETD8 in prostate cancer LNcaP and PC3 cells detected by Western blotting

①与SETD8-Mut3'UTR比较，P<0.01。

图7 3组基因检测结果双荧光素酶报告基因

①Compared with SETD8-Mut3'UTR，P<0.01.

Fig.7 Results of dual-luciferase report gene for three groups

①与对照组比较，P<0.01。

图8 超表达SETD8对前列腺癌细胞系内p53和p21表达水平的影响

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.8 Effect of overexpressed SETD8 on the expression of p53 and p21 in prostate cancer cells

2.5miR-382/SETD8分子轴调控前列腺癌细胞凋亡 由于p53信号通路与细胞凋亡相关，因此推测miR-382/SETD8分子轴能够调控前列腺癌细胞的凋亡。Western blotting结果表明(图9)，与对照组比较，超表达SETD8能够明显提高前列腺癌细胞系(LNCaP和PC3)内凋亡抑制因子Bcl-2的表达水平(P=0.001，0.006 8)，抑制凋亡促进因子Bax(P=0.009，P=0.012)和Caspase 9(P=0.042，0.036)的表达。而转染miR-382 Mimic则能够明显提高细胞内Bax(P=0.026，0.015)和Caspase 9(P=0.049，0.019)的表达水平，降低Bcl-2的表达水平(P=0.025，0.008)。回复实验表明，与单独超表达SETD8组比较，同时转染miR-382 Mimic能够抑制Bcl-2的表达(P=0.039，0.043)，并促进Bax(P=0.012，0.006)和Caspase 9(P=0.021，0.043)的表达。表明miR-382能够促进细胞凋亡，而SETD8能够抑制细胞凋亡。该结果提示，miR-382可能通过SETD8促进前列腺癌细胞凋亡。

①与对照组比较，P<0.01。

图9 Western blotting法检测miR-382/SETD8分子轴调控细胞凋亡结果

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.9 Regulation of miR-382/SETD8 axis on apoptosis detected by western blotting

2.6miR-382通过SETD8调控前列腺癌细胞迁移 Transwell细胞迁移实验结果见图10，与对照组比较，miR-382 Mimic能够明显降低前列腺癌细胞LNCaP和PC3的迁移能力[(334.4±38.18)和(176.8±19.56)比(129.8±16.65)和(50.6±11.36)，均P<0.01]。但是与单独转染miR-382 Mimic组相比，同时超表达SETD8并转染miR-382则能够提高细胞的迁移能力[(129.8±16.65)和(50.6±11.36)比(214.8±31.35)和(81.8±10.65)，均P<0.01]。Western blotting结果见图11。与对照组比较，超表达SETD8能够提高前列腺癌细胞内N-cad(P=0.008，0.004 3)和Vimentin(P=0.015，0.035)的表达水平，并抑制E-cad的表达(P=0.003，0.001)。转染miR-382 Mimic能够抑制N-cad(P=0.001，0.004)和Vimentin(P=0.029，0.018)的表达，提高E-cad的表达水平(P=0.023，0.031)。与单独转染miR-382 Mimic组比较，同时转染miR-382 Mimic并超表达SETD8能够明显提高N-cad(P=0.003，0.045)和Vimentin(P=0.008，0.012)的表达水平，抑制E-cad(P=0.007，0.028)的表达。以上结果说明miR-382能够抑制前列腺癌细胞迁移，而SETD8则能够促进细胞迁移。提示miR-382可能通过调控SETD8抑制前列腺癌的转移。

①与对照组比较，P<0.01。

图10 Transwell细胞迁移实验结果

①Compared with control group，P<0.01.

Fig.10 Result of cell migration test by transwell

①与对照组比较，P<0.05。

图11 Western blotting检测miR-382/SETD8分子轴调控细胞迁移结果

①Compared with control group，P<0.05.

Fig.11 Regulation of miR-382/SETD8 axis on cell migration detected by western blotting

3 讨论

前列腺癌严重危害男性健康，目前患者已对多种化疗药物产生耐药性，严重限制化疗的疗效[19]。普萘洛尔是一种治疗心律失常的药物，目前已被应用于多种癌症的治疗[20]，本课题组前期实验发现普萘洛尔能够抑制前列腺癌的发生、发展，但目前尚不清楚其具体机制。

miRNAs已被报道参与癌症的发生，但笔者目前尚未见文献报道普萘洛尔通过miRNAs抑制前列腺癌。本研究发现，与对照组比较，抑癌因子miR-382在前列腺癌组织和细胞内低表达，并且超表达miR-382能够抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移，并促进细胞凋亡，与ZGANG等[13]研究结果一致，提示miR-382可能是前列腺癌的潜在治疗因子。SETD8能够促进前列腺癌的发生[21]，高表达SETD8能够通过失活p53/p21信号通路，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖[17]。而miR-382能够靶向下调SETD8的表达水平[22]，这与本研究结果一致，笔者发现SETD8在前列腺癌组织和细胞内异常高表达，与miR-382的表达水平呈负相关，并且p53/p21信号通路处于失活状态，提示miR-382/SETD8/p53/p21分子轴可能在前列腺癌的发生、发展过程中扮演重要角色，但尚不清楚普萘洛尔是否通过调控miR-382/SETD8/p53/p21分子轴治疗前列腺癌。

进一步研究发现，普萘洛尔能够明显提高前列腺癌细胞内miR-382的表达水平，降低SETD8的表达并激活p53/p21信号通路。实验结果证实，普萘洛尔能够通过提高前列腺癌细胞内miR-382的表达水平，miR-382抑制SETD8的表达，解除SETD8对p53/p21信号通路的抑制作用，激活p32/p21信号通路，抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡，并延长荷瘤小鼠的生存时间。LI等[15]研究发现，普萘洛尔能够抑制婴儿血管瘤细胞内miR-382的表达水平，进而抑制其发展。本研究结果与之不一致，提示普萘洛尔和miR-382可能对不同癌症具有不同的效果，其具体机制仍需进一步探究。以上结果表明，普萘洛尔能够通过调控miR-382/SETD8/p53/p21分子轴抑制前列腺癌的发生、发展和转移。值得注意的是，有文献报道发现p53基因在前列腺癌细胞系PC3中存在缺失突变[23]，但目前也有文献证实p53在PC3细胞的增殖和凋亡等生命活动中扮演重要角色。有研究发现lncRNA LINP1能够通过靶向p53，调控前列腺癌细胞系p53的增殖能力[24]。除此之外，4-FTSC(4-Fluorobenzaldehyde limonene-based thiosemicarbazone)能够通过调控p53蛋白的表达，诱导PC3细胞发生凋亡[25]，其具体机制仍需进一步探究。

综上所述，本研究证实普萘洛尔可以作为前列腺癌的潜在治疗药物，并且揭示普萘洛尔通过miR-382/SETD8/p53分子轴抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡的分子机制，为前列腺癌的治疗提供了新的靶标。