高效液相色谱法测定体外透皮样品中氧化苦参碱的含量

高白冰，李叶，赵颖，刘晓畅

（1.沈阳医学院基础医学院2015级临床医学专业，辽宁 沈阳 110034；2.陕西省人民医院药学部；3.沈阳医学院药学院沈阳医学院转化医学研究中心）

苦参碱类生物碱广泛存在于苦参、苦豆子、广豆根等豆种植物中，是一组化学结构近似的生物碱，包括苦参碱、氧苦参碱、槐果碱、槐定碱等多种单体。其中，氧化苦参碱可以稳定红细胞和溶酶体，减少炎症介质的释放，具有抗炎、抗过敏的作用，对各型湿疹均有较好的疗效，对急性湿疹、亚急性湿疹、接触性皮炎等皮肤炎症病变的疗效尤为明显，其各类制剂已广泛应用于临床［1-3］。

经皮给药系统具有诸多优点，如避免首过效应、毒副作用少和患者依从性好等，既可通过血液循环起到全身治疗作用，又可制成软膏等局部制剂直接涂于患处直接发挥疗效［4］。因此，氧化苦参碱十分适合制成外用经皮给药制剂。但是，区别于其他给药途径的是，体外透皮实验是经皮给药制剂处方筛选常用的方法之一，该实验必须使用离体皮肤这一生物样品进行，为接收液中药物的定量带来了难度［5］。因此，本研究拟开发一种高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography，HPLC），用于测定透皮样品中氧化苦参碱的含量，为氧化苦参碱透皮制剂处方筛选提供依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠6只，体重180～220 g，6～8周龄，购买于辽宁长生生物有限公司，实验动物许可证号 SCXK（辽）2015-0001。

1.2 药品与试剂 氧化苦参碱对照品 （批号：110780-201508）购自北京中科质检生物技术有限公司，纯度 （98%，HPLC）。氧化苦参碱原料购于南京世洲生物科技有限公司，纯度 （92.5%，HPLC）。乙腈 （上海阿拉丁试剂有限公司）、甲醇（山东禹王集团）、三乙胺 （上海麦克林生化科技有限公司）均为色谱纯，磷酸 （西陇化工股份有限公司）为优级纯，乌拉坦 （上海阿拉丁试剂有限公司）。

1.3 仪器 高效液相色谱仪 （包含自动进样器L-2200，高压泵 L-2130和紫外检测器 L-2420）（日立 （中国）有限公司）、多功能透皮扩散仪SYT-102（延吉艾迪扼科技有限公司）、台式离心机Legend Micro17（美国赛默飞世尔科技公司）、全新智能纯水／超纯水一体化系统 （美国PALL公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Spherisorb ODS2 C18色谱柱（4.6 mm×200 mm， 5μm）， 流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液 （10∶90，V∶V），并用三乙胺调节pH至3.1。流速1.0 ml／min，检测波长为207 nm，柱温60℃，进样量20μl。在上述色谱条件下，氧化苦参碱的理论塔板数不少于2 000，分离度为1.2。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定氧化苦参碱对照品20.0 mg，置于100 ml容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为200μg／ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液2.5 ml，置于50 ml容量瓶并用纯水定容至刻度，得浓度为10μg／ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取Wistar大鼠，使用20%乌拉坦腹腔注射 （5.0 ml／kg）麻醉，将腹部毛发小心剔除，用眼科剪刀去除皮下组织得大鼠离体皮肤，备用。将约1 cm2大鼠离体皮肤在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡12 h，浸泡液于13 000 r／min 4℃低温离心5 min，取上清液作为空白透皮液。在空白透皮液中加入10μg／ml原料药溶液，涡旋混匀即得模拟的供试品溶液［6］。上述动物实验均已获得沈阳医学院伦理委员会的批准。

2.3 专属性 将空白透皮液、对照品溶液和供试品溶液，分别使用2.1项下色谱条件进样，色谱图见图1。由色谱图可知，在该色谱条件下大鼠离体皮肤溶出物对氧化苦参碱的测定无干扰。

图1 氧化苦参碱的HPLC图

2.4 定量限与检测限 取氧化苦参碱对照品溶液适量，用蒸馏水逐步稀释，按上述色谱条件进样测定，结果表明，氧化苦参碱的定量限为3 ng（信噪比S／N＝10），检测限为1 ng（信噪比S／N＝3）。

2.5 线性与范围 取200μg／ml氧化苦参碱对照品储备液2、2.5、0.5、0.5、0.1、0.5 ml分别置于10、 25、 10、 25、 10、 100 ml容量瓶中， 用甲醇稀释定容至刻度，摇匀，制成浓度为40、20、10、4、2、1μg／ml的氧化苦参碱标准溶液。 进样20μl， 将药物浓度 X （μg／ml） 与峰面积 Y进行线性回归，得回归方程Y＝29 985.0X-2 174.8，相关系数 （R2）＝0.999 9。结果表明，氧化苦参碱在1.055～42.2μg／ml范围内，呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取氧化苦参碱对照品溶液20μl，在上述色谱条件下连续重复进样6次，测定氧化苦参碱的峰面积。结果表明，氧化苦参碱峰面积为314 172±3 613，RSD为1.15%，表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验 取6只Wistar大鼠按 “2.2.2供试品溶液的制备”项下制备6份供试品溶液。按上述色谱条件进行测定，计算含量。结果表明，供试品溶液中氧化苦参碱的含量平均值为5.14 μg／ml，RSD为1.97%，表明方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验 取氧化苦参碱原料药0.0151 g，置于1 000 ml容量瓶中，以空白透皮液为溶剂定容至刻度，摇匀。然后将该溶液于32℃恒温水浴下分别放置0、2、4、8、12、24 h后，按上述色谱条件测定，氧化苦参碱峰面积为450 593±11 535，RSD为2.56%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.9 回收率试验 以空白透皮液为溶剂，配制1、20、40μg／ml的低、中、高三个浓度的氧化苦参碱溶液各3份，于13 000 r／min 4℃低温离心5 min后进样，将测得的药物峰面积带入上述标准曲线方程，求得药物浓度与理论浓度的比值得到回收率。低、中、高3种浓度的平均回收率依次为（99.7±0.6）%、 （100.2±0.5）%、 （100.6±0.4）%，均在98%～102%之间，回收率良好。

2.10 样品含量测定 分别使用椰子油和霍霍巴油为油相，使用机械搅拌乳化法制备两种水包油型氧化苦参碱软膏，分别取氧化苦参碱软膏500 mg于立式扩散池的供给池中，接收池中加入4 ml pH为7.4的磷酸盐缓冲液作为接收液，在32℃恒温下每2 h取样2 ml，并补加新鲜的磷酸盐缓冲液2 ml，共计透皮 8 h。获得的体外透皮样品按2.2.2项下对样品进行处理，并按2.1项下的色谱条件进行测定，以外标法计算含量，结果见图2，处方一和处方二的8 h累积透过量分别为 （19.97±3.58） μg／cm2和 （7.62±2.37） μg／cm2。 结果表明，该HPLC法可用于透皮制剂的处方筛选。

3 讨论

3.1 波长的选择 取氧化苦参碱对照品溶液进行全波长扫描，在200～600 nm范围内氧化苦参碱在207 nm处有最大吸收峰，因此选择207 nm作为测定波长。

3.2 色谱条件的选择 本研究对流动相系统 （乙腈-水系统和甲醇-水系统）进行考察。结果乙腈-水系统在低波长207 nm下可以获得满意的色谱峰峰形。此外，柱温对于氧化苦参碱的分离效果具有较大的影响。在该流动相条件下，25、35、40、50℃时，氧化苦参碱色谱峰峰形差，且不能与杂质峰分离；柱温为60℃时分离效果好，出峰时间快。因此，最终选择乙腈-0.3%磷酸水溶液（10∶90，V∶V），柱温60℃为色谱条件。

图2 使用HPLC法测定的不同透皮制剂中氧化苦参碱的累积透过量

综上所述，本研究所建立的HPLC方法操作简单，线性、精密度、重复性、稳定性、回收率良好，能准确测定体外透皮样品中氧化苦参碱的含量，可作为氧化苦参碱处方筛选的检测方法。