类叶牡丹提取物通过NF-κB信号通路影响类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖及凋亡

曾茂湘，吕兆宇，李妍

（深圳市龙岗区第二人民医院外二科，广东 深圳 518112）

类风湿关节炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一种由环境因素和遗传因素共同影响，与多种基因有关的自身免疫炎性疾病，严重者可出现关节畸形，致残率非常高，严重影响患者的日常工作和生活［1］。在RA的病理过程中机体的免疫调节网络失衡，促炎因子分泌增多，炎性细胞募集活化，诱发成纤维样滑膜细胞 （fibroblast-like synoviocytes，FLS）异常增殖，表现出类肿瘤细胞样的特性，分泌基质金属蛋白酶 （MMPs）和炎性因子，参与炎症反应，损伤骨及关节软骨［2］。NF-κB信号通路介导的细胞凋亡对FLS的存活和增殖有重要的影响［3］。 类叶牡丹 （Caulophyllum robustum Maxim，CRM）临床上常被用于跌打损伤、RA、胃痛等治疗，有活血理气的功效。本文以从RA患者关节处分离的FLS为细胞模型，研究CRM提取物 （CRME）抗RA的药理作用及NF-κB信号通路的参与机制，为CRM的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 选取2018年12月至2019年12月在我院骨科或者风湿病科因RA行关节清理手术的25例患者的滑膜组织，分离出FLS为RA-FLS组，其中男7例，女18例，平均年龄 （55.86±12.93）岁；另取同期因非RA行手术患者的滑膜组织，分离出FLS为空白对照，其中男10例，女15例，平均年龄 （53.71±13.07） 岁。 纳入标准： （1）RA患者符合2010年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟的RA分类标准； （2）对照组患者为因外伤进行关节手术的非RA患者； （3）患者对研究知情同意且签署协议书。排除标准： （1）患者存在严重心脑血管或肝肾疾病； （2）肿瘤、痛风、甲亢、糖尿病、结核病及其他内分泌代谢疾病患者；（3）术前进行免疫治疗的患者；（4）存在除RA外的自身免疫性疾病患者。本研究经医院伦理委员会审查，研究对象的一般资料比较差异无统计学意义。

1.2 药品和试剂 CRM根茎 （四川恒源医药有限公司）由黑龙江中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品；PDTC（NF-κB信号通路抑制剂） （美国AbMole公司）；四甲基偶氮唑蓝 （MTT） （上海碧云天生物技术有限公司）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-4（IL-4）、血管内皮生长因子（VEGF）、Bax、Bcl-2、p65的ELISA试剂盒 （美国R＆D Systems公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 （上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM培养基 （美国Gibco公司）；胎牛血清 （美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素 （上海碧云天生物技术有限公司）；DMSO（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 仪器 SW-CJ-2F超净工作台 （上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；HEARcell 150i二氧化碳培养箱 （美国赛默飞世尔科技公司）；FV1000共聚焦显微镜 （日本奥林巴斯）；SpectraMax Paradigm酶标仪 （上海美谷分子仪器有限公司）；BD FACSCalibur流式细胞仪、Avanti J-E离心机 （美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 CRME的提取 取1 kg CRM根茎，加入95%乙醇浸泡24 h，回流提取2 h，重复2次，以70%乙醇和纯净水 （V／V）于AB-8大孔树脂洗脱，将洗脱液浓缩，浓缩液静置24 h后抽滤，将滤液于55℃进行旋蒸，收集固体粉末，称重，得212.53 g，提取率为21.253%。

1.4.2 FLS分离、培养及鉴定 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤无菌条件下收集的关节滑膜组织3次，去除脂肪组织后将其剪碎，以胰酶和胶原酶依次消化30 min和3 h，用DMEM培养基重悬FLS，置于5%CO237℃条件下培养，传至2～3代进行后续实验。原代细胞培养3代后，细胞形态呈三角形或梭形，免疫荧光染色显示波形蛋白 （Vimentin） （＋）、 CD68 （-）。

1.4.3 MTT法检测FLS细胞增殖活性 取正常组、RA-FLS组原代FLS于96孔细胞培养板中接种1×105个细胞／孔，培养24 h后将上清弃去。将RA-FLS组分为5组，RA-FLS组加入不完全培养基，给药组加入含浓度为 50、100、500μg／ml CRME的不完全培养基和给予含50μmol／L PDTC的不完全培养基；正常FLS为对照，加入不完全培养基。每个组别设置5个复孔。继续培养24 h，每孔加入5 mg／ml的 MTT溶液20μl，37℃ 5%CO2培养箱中孵育4 h，弃去上层培养液，加入二甲基亚砜 （DMSO）溶液150μl，于摇床上振荡10 min，用酶标仪测各孔在490 nm处的吸光度值，计算抑制率。

1.4.4 ELISA法检测细胞因子表达水平 按照ELISA试剂盒说明书检测 IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65的表达水平。实验重复3次。

1.4.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，PBS重悬后离心，以Annexin V-FITC结合液重悬细胞，以Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，避光室温孵育20 min后冰浴，流式细胞仪检测后采用CFlow Plus软件分析。实验重复3次。

1.5 统计学方法 采用Graphpad prism 6软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，各组的OD值、细胞因子表达水平和凋亡率的组间比较采用One-way ANOVA检验和 Student′st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRME和PDTC对FLS增殖活性的影响 给药后24 h，MTT法检测FLS的增殖活性，RA-FLS组与正常组增殖活性比较差异有统计学意义 （P＜0.01）； RA-FLS＋PDTC 组和 RA-FLS＋不同浓度CRME （50、 100、 500 μg／ml） 组 OD 值分别与RA-FLS组比较差异均有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

表1 CRME和PDTC对FLS增殖活性的影响

2.2 CRME和PDTC对FLS IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65表达的影响 和正常组比较，RA-FLS组细胞IL-6、IL-4、VEGF、Bcl-2、p65表达水平显著升高 （P＜0.01）； 和 RA-FLS组比较， RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME 组和 RA-FLS＋PDTC组 IL-6表达水平显著降低 （P＜0.01）， RA-FLS＋100、 500 μg／ml CRME 组和 RA-FLS＋PDTC组IL-4表达水平显著升高 （P＜0.05或0.01）， RA-FLS＋500 μg／ml CRME 组 VEGF表达水平降低 （P＜0.05）。 和RA-FLS组比较，RAFLS＋PDTC 和 RA-FLS＋ 50、 100、 500 μg／ml CRME组 Bax的表达水平显著升高 （P＜0.05或0.01）， RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME 组和RA-FLS＋PDTC组Bcl-2的表达水平差异无统计学意义 （P＞0.05）， RA-FLS＋500 μg／ml CRME 组和RA-FLS＋PDTC组p65的表达水平均显著减低 （P＜0.01）。 见表 2、 表 3。

表2 CRME和PDTC对IL-6、 IL-4、 VEGF表达的影响 （pg／ml）

表3 CRME和PDTC对Bax、Bcl-2、p65表达的影响

2.3 CRME和PDTC对FLS细胞凋亡的影响 正常组细胞凋亡率为 （2.17±0.98）%，RA-FLS组为 （3.79±0.46）%，2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）； RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME组和RA-FLS＋PDTC组细胞凋亡率分别为 （5.48±1.13）%、 （8.91±0.67）%、 （11.37±1.26）%和（6.83±1.02）%， 和 RA-FLS组比较， 100、 500 μg／ml的CRME和PDTC能够增加细胞凋亡率 （P＜0.05）。

3 讨论

RA是慢性进行性的自身免疫疾病，临床表现为四肢关节的侵袭性、对称性、多关节的关节炎症，病变关节出现肿胀、疼痛及功能障碍，严重者导致关节畸形，严重影响日常生活质量［4］。RA与机体的免疫功能异常有紧密关系，其病理过程有诸多细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞内信号分子和转录因子参与［5］。糖皮质激素和非甾体类抗炎药是当前治疗RA的主要治疗药物，但是特效治疗药物仍然缺乏，且当前抗RA药物的长期使用也存在较多的不良反应。CRM性温，味苦、辛，有理气止痛和祛风活血的功效，研究显示其作用可能和抑制非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫有关［6］。生理情况下，FLS和巨噬细胞样滑膜细胞组成滑膜结构的衬覆细胞层，通过分泌润滑液和细胞外基质，参与维持关节的正常活动功能［7］。当关节出现炎症反应时，某些细胞因子或者趋化因子可激活FLS，激活的FLS异常增殖并加重炎症反应，形成血管翳，同时能够侵蚀骨和软骨，促进骨降解，参与RA的病理进程［8］。因此，抑制RA-FLS的过度增殖或促进其凋亡可能成为治疗RA的有效方式。

本研究选择CRME和NF-κB信号通路的抑制剂 （PDTC），以FLS为研究对象，观察CRME和PDTC对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响及和NF-κB信号通路相关的分子机制。对PDTC和各剂量组的CRME对RA-FLS细胞增殖活性的影响进行探讨，结果显示，和正常组比较，RA-FLS组的细胞增殖活性显著提升；和RA-FLS组比较，PDTC和各剂量组的CRME均减少了RA-FLS的异常增殖。流式细胞术检测PDTC和CRME对RA-FLS凋亡的影响，结果显示RA-FLS组和正常组细胞的凋亡率差异无统计学意义，PDTC和100、500 μg／ml的 CRME升高了 RA-FLS细胞的凋亡率，提示CRME可能通过抑制RA-FLS的异常过度增殖和促进RA-FLS的凋亡发挥抗RA的药理作用。

IL-6和IL-4等细胞因子参与炎症过程，存在于关节滑膜和血清中。IL-6可促进炎症相关的Th17细胞的分化和B细胞的合成，参与炎症过程［9-10］。本研究结果显示，和正常组比较，RAFLS组的IL-6表达水平显著升高，给予PDTC和各剂量组的CRME均能显著降低IL-6的表达水平，提示CRME的抑制炎症反应的作用效果，可能和抑制NF-κB信号通路有关。IL-4为Th2细胞分泌的抑制炎症反应的细胞因子，能够抑制Th1细胞增殖，拮抗TNF-α的炎症效应［11］。和正常组相比，RA-FLS组的IL-4表达水平显著升高，给予PDTC和100、500μg／ml的CRME均能显著升高IL-4的表达水平，提示CRME可能和对Th1／Th2细胞增殖和分化的影响有关。NF-κB信号通路活化后，释放p65并转移入细胞核内，进而调节炎症和凋亡相关的基因表达［12］。 Okamato等［13］研究发现RA病理过程中，NF-κB信号通路活化，抑制其活性能够改善RA。本研究结果显示，和正常组相比，RA-FLS组的p65表达增多，提示NF-κB信号通路活化；PDTC和500μg／ml的 CRME能够降低p65表达，提示CRME通过抑制NF-κB信号通路活化进而发挥改善炎症和对RA的治疗作用。

研究显示，VEGF能够提升血管内皮细胞形成管腔的能力，诱导血管内皮细胞增生和迁移，与血管翳的形成密切相关，RA患者血清中的VEGF水平高于健康对照组［14-15］。软骨破坏也与其表达升高有关，本研究结果显示和正常组相比，RAFLS组细胞表达 VEGF增多；500μg／ml的 CRME能够降低RA-FLS表达VEGF，PDTC则无此效果，RA病理过程中血管新生受到多种因素的影响，有研究显示缺氧能够激活血管生成的级联反应，促进RA的发展［16］，提示CRME可能通过降低VEGF表达发挥抗RA作用。Bax是经典的促凋亡因子，Bcl-2发挥抗凋亡作用，Perlman等［17］研究显示Bcl-2在RA患者的滑膜组织中表达升高，影响FLS的凋亡。本研究结果显示，PDTC和各浓度的CRME均显示出升高RA-FLS的Bax表达水平的作用，对RA-FLS的Bcl-2表达水平没有显著影响，说明CRME可能通过上调促凋亡因子Bax的作用机制促进RA-FLS的凋亡。

综上所述，CRME可抑制血管新生，通过抑制NF-κB信号通路活化减轻炎症反应，抑制FLS增殖并促进其凋亡，发挥抗RA的药理作用。