肿瘤患者围手术期自异体输血对输血相关免疫调节效应影响的比较

黄晶， 付佳

（1.孝感市中心医院检验科，湖北 孝感 432000；2.沈阳医学院基础医学院）

异体输血是围手术期治疗的重要手段［1］。然而，异体输血引起机体多种不良反应的问题也受到越来越多的关注［2］。以往对输血副作用的认识多局限在溶血性输血反应和疾病传播，而对输血造成的免疫抑制作用认识不足［3］。有研究结果表明，血液作为一种免疫原性和反应原性物质，在输血过程中会伴随产生一系列涉及免疫调节的副反应，称之为输血相关免疫调节效应 （transfusion-relelated immunomodulation， TRIM）［4］。 异体输血对受血者机体免疫系统的抑制作用是相当广泛的，涉及体内多种免疫细胞数量及其功能、淋巴细胞不同亚群之间的比例失调、各类免疫球蛋白含量变化、细胞因子浓度消长、补体系统分子浓度变化等多方面的改变［5］。然而，对于肿瘤患者而言，免疫功能的变化是肿瘤患者在术后能否彻底清除肿瘤细胞的关键因素。因此有学者根据临床研究结果，提出了输血可能导致肿瘤手术后癌肿复发率增高、增加死亡风险的假说［6］，并且得到随后进一步研究的证实［7］。与异体输血比较，围手术期自体输血方法不仅在避免疾病传播、溶血性输血反应、发热及过敏、移植物抗宿主反应等方面明显优于对照，而且能够明显降低或消除输血对患者免疫功能的抑制作用［2］。因此，探讨围手术期异体输血与自体输血对患者免疫系统的影响意义重大。

本研究通过对我院围手术期需要输血的妇科恶性肿瘤患者进行等容稀释自体输血和异体输血，然后测量不同时段外周血中免疫物质含量的变化，分析两种输血方式对肿瘤患者T淋巴细胞及其亚群、细胞因子的变化，为肿瘤患者围手术期选择合理输血方式、科学地分析其对肿瘤患者术后免疫状态的影响提供必要的理论依据和临床研究资料。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年12月至2019年4月孝感市中心医院收治的实施妇科恶性肿瘤根治术的患者60例为研究对象，将患者随机分为观察组和对照组，各30例，其中观察组采用等容稀释自体输血，对照组采用异体输血。纳入标准：患者在手术前3个月内均无输血史，且术前及术后30 d内均未予放、化疗和免疫治疗。所有患者术前血红蛋白＞120 g／L，红细胞比容＞35%。排除标准：内分泌及免疫性疾病者；血源性传染病者。2组患者的年龄、术中出血量、输血量、手术时间、肿瘤类型及术式差异均无统计学意义 （P＞0.05），见表1。2组患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

表1 2组患者一般资料及手术概况比较 （±s）

表1 2组患者一般资料及手术概况比较 （±s）

组别 n 年龄 （岁） 失血量 （ml） 输血量 （ml） 手术时间 （min） 肿瘤类型 术式对照组 30 65.36±4.87 273±91 400±50 194±40 恶性 根治术观察组 30 65.41±4.69 276±95 400±50 196±42 恶性 根治术

1.2 方法 2组患者手术均采用静脉复合麻醉。观察组患者，麻醉后术前经桡动脉采血400～600 ml，同时经静脉输入相当容量的羟乙基淀粉，术中根据情况将自身血回输。对照组患者，输异体全血400～600 ml。2组患者均在术前，以及术后第1天、第7天分别取外周静脉血4 ml／次，每2 ml置于1个EDTA-K2抗凝试管中，共2管，即刻送到检验科 （注：用于测定T淋巴细胞亚群的抗凝血无需离心，4℃冷藏备用，使用前充分混匀；用于测定细胞因子的抗凝血，3 000 r／min离心30 min取上清，-80℃冻存，备用）。

1.2.1 流式细胞仪检测T淋巴细胞 （1）免疫荧光标记T淋巴细胞。混匀前述冷藏备用的抗凝全血，加100μl全血于试管中，分别加入抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP以及 CD4-APC单克隆荧光抗体各20μl，用振荡器充分混匀后，4℃，避光孵育20 min，4℃保存备用。（2）流式细胞仪检测分析 （仪器型号及配套试剂生产厂家：美国BD公司FACSCalibur，试剂：美国BD公司淋巴细胞亚群检测试剂盒）。检测前，流式细胞仪采用BD Calibrite标准荧光微球，按照FACSComp程序，校准荧光通道FL1（标记物—FITC异硫氰酸荧光素）、FL2（标记物—PE藻红蛋白）、FL3（标记物—PerCP多甲藻黄素）、FL4（标记物—APC别藻蓝蛋白）及侧向散射光（SSC）、前向散射光 （FSC）通道的准确性。上述染色后细胞，用BD Lysing solution溶血素破坏红细胞后，上机运行和获取≥10 000的颗粒事件。利用含已知数量标准微球的绝对计数管进行绝对计数，结果用双参数散点图表示。

1.2.2 细胞因子检测 采用ELISA方法通过酶标仪对血清中的细胞因子 （IL-2、IL-10、IFN-γ）进行检测分析 （仪器及配套试剂生产厂家：奥地利贝利公司，型号：BL Ecsys）。（1）酶标孔板为48孔，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；（2）样本孔先加待测样本10μl， 再加样本稀释液40μl； 空白孔不加。 （3）除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶 （HRP）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。（4）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次 （也可用洗板机洗板）。（5）每孔加入底物 A、B各 50μl，37℃避光孵育 15 min。 （6） 每孔加入终止液50μl，15 min内， 通过酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值。（7）通过酶标仪绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。其中IL-2的参考值为15～100 pg／ml， IL-10的参考值为＜5 pg／ml， IFN-γ 的参考值为 15～200 pg／ml。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验；计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者T细胞及各T细胞亚群构成比的变化情况比较 其中1例患者双参数散点图举例见图 1。 术后第 1天，2组患者的 CD3＋、CD4＋、CD8＋细胞数占T细胞百分比与术前相比均显著减少 （P＜0.05）； 术后第7天， 对照组患者的CD3＋、CD4＋、CD8＋细胞 （外周血中极少存在双阳性T细胞）所占百分比显著少于同组术前 （P＜0.05），观察组与同组术前比较差异无统计学意义 （P＞0.05）； 观察组患者 CD3＋、 CD4＋、 CD8＋细胞数在T细胞中所占百分比明显高于对照组 （P＜0.05），见表2。

表2 2组患者T淋巴细胞亚群占比的变化情况 （±s，%）

表2 2组患者T淋巴细胞亚群占比的变化情况 （±s，%）

注：与同组术前比较，1）P＜0.05；与对照组比较，2）P＜0.05。CD3＋、CD4＋、CD8＋细胞所代表的数值是各细胞占T细胞的百分比

时间 组别 n CD3＋ CD4＋ CD8＋术前 对照组 30 65.1±4.1 58.2±5.3 31.7±4.7观察组 30 67.2±5.1 59.9±4.8 32.4±4.3术后第1天 对照组 30 52.1±5.4 1） 50.7± 3.91） 23.7±4.31）观察组 30 62.7±5.3 1） 52.7±5.1 1） 27.1±3.9 1）术后第7天 对照组 30 51.7±4.51） 46.0±5.21） 22.4±4.21）观察组 30 65.1±4.72） 57.4±4.92） 30.4±4.62）

2.2 2组患者细胞因子的变化情况 术后第1天，观察组患者IL-2、IFN-γ水平，对照组患者IL-10水平较本组术前显著升高 （P＜0.05）；对照组患者IL-2、IFN-γ水平，观察组患者IL-10与本组术前比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05）。术后第7天，观察组患者细胞因子水平与术前比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05），对照组患者IL-2、IFN-γ水平较术前显著减少，IL-10水平较术前显著增加 （P＜0.05）； 观察组患者的IL-2、IFN-γ水平显著高于对照组患者 （P＜0.05），2组IL-10水平比较差异无统计学意义。见表3。

3 讨论

免疫功能高低对于肿瘤患者的预后十分重要，异体输血可能使被输血的肿瘤患者免疫功能受到抑制，增加患者术后肿瘤复发率，使其存活时间缩短［8］。

T细胞亚群在肿瘤免疫监视中起重要作用，对判断肿瘤的发展及预后转归有着重要意义。本研究结果显示术后第7天对照组CD3＋、CD4＋、CD8＋比观察组显著下降，提示术后机体免疫状况下降，可能是因为异体输血导致机体免疫力受到抑制。兰炯采等［9］研究发现可溶性HLA-类抗原分子和Fas配体存在于同种异体血的血清中，它们可以结合相应的配体，通过封闭受体和诱导凋亡来抑制T细胞功能。

IL-2具有活化T细胞，促进细胞因子产生，增强NK细胞活性，促进B细胞增殖分化，激活巨噬细胞的功能；IFN-γ可以抑制肿瘤细胞的增殖，它们活性的增高有利于抑制和排除细菌，增强患者术后抗感染能力及伤口愈合能力。本研究结果显示术后第1天，观察组IL-2和IFN-γ显著增高，在术后第7天恢复至正常水平，表明自体输血对机体免疫抑制影响不明显。异体血的淋巴细胞可以在受血者体内长期存活，使Th2型淋巴细胞分泌IL-10增多，抑制Th1型细胞分化发育，IL-2、IFN-γ分泌减少［11］。本研究结果显示术后第1天对照组IL-10显著上升，但是观察组患者未见明显上升；术后第7天，对照组IL-10仍然显著高于术前，而IL-2、IFN-γ显著低于术前，可能是因为异体输血下调被输血者的免疫反应，造成免疫失衡，免疫反应由细胞免疫向体液免疫偏离，被输血者抵抗感染能力下降。

图1 1例恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞及CD4＋、CD8＋亚群分析双参数散点图

表3 2组患者围手术期细胞因子的变化 （±s）

表3 2组患者围手术期细胞因子的变化 （±s）

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综上所述，肿瘤患者围手术期可采用自体和异体两种输血方法，这两种方法对T淋巴细胞及不同亚群数量及功能变化具有不同的影响，自体输血对恶性肿瘤患者免疫功能影响较小，异体输血明显抑制患者免疫功能。