原发性干燥综合征患者外周血调节性B细胞表达水平及意义

孙超，王健，王信，郭文静，李志军

（蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科，安徽 蚌埠 233000）

干燥综合征是一种主要侵犯机体唾液腺、泪腺、外分泌腺，且随病情进展可累及其他器官、系统损害的自身免疫性疾病，患者主要临床表现为口咽干燥等［1］。目前，对于干燥综合征的发病机制尚处于研究探索阶段。研究指出，体液因子、细胞因子、环境、遗传等因素在干燥综合征发病中起到了重要作用，是多种因素共同作用的结果［2-3］。在干燥综合征发病过程中，部分细胞因子具有辅助机体免疫系统中细胞之间信号传递，趋化免疫细胞到达泪腺、唾液腺等分泌腺体，以及调节免疫功能的作用［4］。近年来研究发现，调节性B细胞 （Bregs）能够通过分泌转化生长因子β1（TGF-β1） 及白介素-10（IL-10） 等细胞发挥负向调控免疫的作用［5］。研究显示，在多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎中，Bregs表达水平均出现异常［6］。本研究通过检测原发性干燥综合征患者外周血Bregs细胞水平变化情况，分析了Bregs在原发性干燥综合征发病机制中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取蚌埠医学院第一附属医院2017年1月至2019年4月收治的36例干燥综合征患者作为病例组，入选标准： （1）均符合干燥综合征的诊断标准［7］； （2） 均为初治者； （3） 入组前均未接受免疫抑制剂、糖皮质激素等治疗；（4）均为原发性干燥综合征；（5）研究对象及家属均对本研究知情同意。排除标准： （1）存在精神障碍、智力障碍以及认知功能障碍者； （2）伴有恶性肿瘤或者肾功能衰竭者； （3）合并其他免疫性疾病者；（4）入组时存在急慢性感染者；（5）长期服用甲氨蝶呤、青霉胺、激素等抗风湿药物者；（6）年龄在18岁以下者。36例患者中，男4例，女32例；年龄19～76岁，平均年龄 （50.29±7.84）岁；欧洲风湿病联盟制定的干燥综合征病情评估指数 （ESSDAI）：0～2分11例，3～5分22例，6～8分3例；有系统损伤24例，无系统损伤12例；抗 SSA抗体阳性20例，阴性16例；抗SSB抗体阳性10例，阴性26例。另选取同期门诊健康体检者30例作为对照组，均无急慢性感染、自身免疫性疾病或者自身免疫性疾病家族史，其中男5例，女25例；年龄20～75岁，平均年龄（50.76±7.29）岁。2组研究对象性别、年龄等比较差异均无统计学意义 （P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术检测Bregs细胞水平 抽取研究对象清晨静脉血2 ml，经抗凝处理后取100μl加入至流式细管中，顺序编号之后送检；于流式细管中各加入20μl的APC-CD19单抗、FITCCD24单抗、PE-CD38单抗 （均为美国 BD Biosciences公司产品），并设置同型抗体的对照组，加入20μl的APC-IgG1单抗、FITC-IgG2b单抗、PE-IgG1单抗 （均为美国BD Biosciences公司产品）；混匀之后室温下避光保存30 min，以确保试剂与样本能够充分反应；然后加入红细胞裂解液150μl，震荡混匀，放置于冰箱中避光保存 20 min，温度为4℃；以2 000 r／min离心10 min，弃去上清液，取白细胞沉淀用PBS液洗涤3次，然后分别于2 000 r／min离心10 min，循环离心2次，于沉淀中加入500 ml的PBS液制成单细胞悬液，滤网过滤，使用美国BD公司生产FACSCalibur流式细胞仪进行检测。Bregs细胞水平以Bregs细胞占CD19＋B比例进行表示。

1.2.2 ELISA法检测血清IL-10和TGF-β1水平

抽取所有研究对象清晨静脉血5 ml，离心后取血清置于-70℃冰箱中保存待检；采取ELISA法检测血清IL-10和TGF-β1水平，于检测TGF-β1之前对血清进行酸化处理，以激活血清中的TGF-β1，严格按照试剂盒说明进行。

1.2.3 治疗方法 病例组所有患者均给予醋酸泼尼松联合硫酸羟氯喹治疗，醋酸泼尼松片 （许昌奥森制药有限公司，国药准字H41021232）口服，每天1次，每次5～10 mg；硫酸羟氯喹片 （上海中西制药有限公司，国药准字H19990264）口服，每天1次，每次0.2 g；治疗4周后再次检测外周血Bregs细胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平。

1.3 观察指标 比较2组研究对象外周血Bregs细胞水平及血清IL-10和TGF-β1水平，比较病例组不同临床特征患者外周血Bregs细胞水平，比较治疗前后外周血Bregs细胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平，分析治疗前外周血Bregs细胞水平与血清IL-10、TGF-β1水平的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组计量资料采用方差分析、q检验，相关性分析采用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组研究对象外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 病例组外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均显著高于对照组 （P＜0.01）， 见表1。

表1 2组研究对象外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 （±s）

表1 2组研究对象外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 （±s）

组别 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）对照组 30 1.34±0.67 27.45±7.62 12.05±4.37病例组 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49 t值 10.206 9.033 3.924 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 不同临床特征干燥综合征患者外周血Bregs细胞水平比较 抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性患者外周血Bregs细胞水平均显著高于抗SSA抗体、抗SSB抗体阴性患者 （P＜0.05）；不同年龄、性别、ESSDAI评分以及有无系统损伤患者之间外周血Bregs细胞水平比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05）， 见表 2。

表2 不同临床特征患者外周血Bregs细胞水平比较 （±s）

表2 不同临床特征患者外周血Bregs细胞水平比较 （±s）

指标 n Bregs（%） 统计值 P值年龄 （岁）≥60 14 4.86±1.94 0.501 0.620＜60 22 4.53±1.92性别男4 4.89±1.89 0.349 0.729女32 4.63±1.95 ESSDAI评分 （分）0～2 11 4.12±1.79 1.134 0.273 3～5 22 4.65±1.84 6～8 3 5.26±2.06系统损伤有24 5.21±1.97 1.129 0.267无12 4.48±1.49抗SSA抗体阳性 20 5.34±1.68 2.207 0.034阴性 16 4.07±1.76抗SSB抗体阳性 10 5.48±1.79 2.256 0.030阴性 26 4.03±1.57

2.3 干燥综合征患者治疗前后外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 治疗4周后，干燥综合征患者外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均显著低于治疗前 （P＜0.01）， 见表 3。

2.4 干燥综合征患者治疗前外周血Bregs细胞水平与血清 IL-10、TGF-β1水平的相关性Spearman相关性分析结果显示，外周血Bregs细胞水平与血清IL-10、TGF-β1水平均呈正相关 （r分别为 0.589、 0.004，P＜0.05）。

表3 干燥综合征患者治疗前后外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 （±s）

表3 干燥综合征患者治疗前后外周血Bregs细胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比较 （±s）

组别 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）治疗前 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49治疗后 36 2.79±1.26 31.09±12.38 13.46±4.58 t值 5.131 8.924 3.007 P值 0.000 0.000 0.004

3 讨论

干燥综合征是一种累及机体外分泌腺体，主要是以侵犯泪腺以及唾液腺为主的自身免疫性疾病，多见于中老年女性，对患者生活质量造成严重影响。干燥综合征病理特征为唾液腺以及泪腺等外分泌腺体中IgG型浆细胞、单核细胞、淋巴细胞大量浸润为特点，进而引起外分泌腺功能障碍，患者临床表现为眼干、口干等，部分患者还会出现脏器与系统损伤。干燥综合征病因及发病机制目前并未完全明确，研究认为该病的发生与多种细胞因子异常释放相关［8］。干燥综合征起病缓慢，在诊断时容易出现漏诊误诊，临床中该病主要以对症治疗为主，延缓病情发展，改善口干、眼干等临床症状。

部分学者认为，机体中B淋巴细胞所介导的体液免疫，可以产生多种免疫复合物、多克隆免疫球蛋白以及自身抗体，造成外分泌腺破坏以及多系统损害［9］。Bregs可以通过分泌多种细胞因子，间接或者直接作用于其他免疫细胞，进而发挥抑制炎症反应的作用。本研究中，病例组外周血Bregs水平显著高于健康对照组，这与相关研究结果［10］一致，说明Bregs可能参与了干燥综合征的发病过程。进一步对不同临床特征患者外周血Bregs细胞水平分析发现，不同年龄、性别患者之间，外周血Bregs细胞水平比较差异无统计学意义；而且在不同ESSDAI评分以及有无系统损伤患者之间，外周血Bregs细胞水平比较差异亦无统计学意义，说明Bregs可能与干燥综合征疾病活动并无密切关系。抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性患者外周血Bregs细胞水平均显著高于抗SSA抗体、抗SSB抗体阴性患者，说明干燥综合征患者Bregs细胞水平异常可能与免疫功能紊乱有密切关系［11］。

研究指出，Bregs水平在干燥综合征患者及健康人当中，具有减轻CD4＋T细胞所介导的炎症反应的作用［12］。本研究中，治疗4周之后，干燥综合征患者外周血Bregs表达水平较治疗前显著降低。经过治疗之后，Bregs相应减少，机体内的炎症反应减轻，患者免疫调节功能改善，病情得到缓解。Bregs可以分泌抑制性细胞因子TGF-β1以及IL-10，在介导免疫耐受以及调节免疫应答当中具有重要作用。Bregs通过分泌TGF-β1可以促进效应T细胞凋亡，减少与炎症相关的CD8＋T细胞的数量，减少效应性T细胞上T细胞抗原受体的表达数量，削弱辅助T细胞的活化，抑制自身免疫性疾病的进展。IL-10能够有效地抑制炎症因子释放及T细胞增殖，对于调节性T细胞分化或者维持起到重要作用［13］。本研究中，外周血 Bregs表达水平与血清IL-10、TGF-β1水平均呈显著正相关性，说明Bregs可能通过分泌TGF-β1及IL-10影响机体其他免疫细胞，即发挥负向调节作用，从而维持自身免疫耐受。

综上所述，干燥综合征患者外周血Bregs表达水平显著升高，可能与干燥综合征的发病有一定关系，且患者Bregs表达水平异常可能与自身免疫功能紊乱有关，但Bregs表达水平与干燥综合征的疾病活动无直接相关性。