文冠果组织培养无菌体系的建立

王斯彤

(1.辽宁省沙地治理与利用研究所，辽宁 阜新 123000;2.辽宁章古台科尔沁沙地生态系统国家定位观测研究站，辽宁 阜新 123000)

文冠果Xanthocerassorbifolia为无患子科文冠果属多年生木本植物，素有“千花一果”之称。文冠果是中国特有的温带木本油料植物[1]，由于其种子和种仁都具有较高的含油量，因此也被誉为“北方油茶”[2]。作为落叶乔木或灌木的文冠果具有根系发达、萌蘖力强的特点，可广泛用于固沙造林、绿化荒山[3]，是良好的水土保持树种。由于对文冠果需求和利用量不断增加，如何提高其产量迫在眉睫。目前，文冠果的主要繁殖方式为种子繁殖，但其种子发芽率仅为6%[4]，且种子繁殖的弊端在于个体性状差异显著，子代很难保持亲本的优良性状，而嫁接繁殖成功率较低，人工费用较高。因此，通过研究文冠果组织培养及器官再生，可以从根本上解决种源不足的问题，快速繁殖文冠果苗，提高产量并保持个体优良性状[5-6]。

目前，已有利用文冠果无性器官进行离体培养研究的报道，柳金凤等[6]采用文冠果茎段及种子萌发获得的嫩茎作为外植体进行组织培养，成功获得无菌苗；宋群雁[7]等用文冠果叶片作外植体进行离体培养，成功获得生根苗。虽然目前通过离体培养方式能够获得无菌苗，但为实现工厂化育苗及降低工厂化育苗成本，需要对整个无菌体系进行优化。

本研究以章古台地区筛选获得的文冠果优系4号茎段为外植体，通过器官直接发生途径对不定芽进行诱导，对不定芽诱导的无菌体系建立进行系统研究，为文冠果快速繁殖建立系统的无菌体系，为文冠果组培苗增殖和生根研究提供丰富材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以文冠果优系4号嫁接苗1年生茎段为外植体。一般5月中旬，在章古台地区采集生长良好、无病虫害的新萌发枝条，每隔15 d采集1次外植体，直至1年生枝条完全木质化。采回的枝条去除叶片，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 外植体预处理

将枝条剪成长约2.5 cm带腋芽或顶芽的小段，去除叶片，加少量洗衣粉并用软刷清洗表面杂质，将茎段置于广口瓶中用流水冲洗1～2 h，用蒸馏水冲洗6次，放在超净工作台上备用。

1.2.2 消毒时间优化

先用75%乙醇20 s消毒2次，然后用无菌水冲洗2次，用0.1%HgCl2分别消毒3、6、9、12 min，用2%NaClO消毒5、10、15、20 min，再用无菌水震荡清洗3次。将处理后的茎段切除底端和顶端，每个小茎段上留1个腋芽，最后将茎段在无菌操作下接入培养基中培养。每个处理重复3次，共接种30个茎段。接种后4周记录污染率和萌发率。

1.2.3 外植体最佳取材时间

选择生长健壮、无明显病虫害的文冠果优系4号，以当年萌发的茎段作为外植体，分别于5、6、7、8、9、10月采集，每隔15 d采集1次。采后的茎段去叶冲洗后置于超净工作台上备用。先用75%乙醇20 s消毒2次，再用0.1%HgCl2消毒9 min，无菌水冲洗6次。消毒后的茎段用无菌滤纸吸干表面水渍，切去顶端和底端，保留1个腋芽，将茎段接种到DKW培养基中，每瓶2个茎段，每次接种40瓶，接种后4周记录污染率和萌发率。

1.3 数据分析

采用Excel 2007处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 不同消毒试剂对外植体的消毒效果

从表1可以看出，消毒效果最好的处理是0.1% HgCl2消毒12 min，污染率49.3%；虽然0.1% HgCl2消毒9 min的污染率54.4%，但萌发率最高35.6%。可以得出，虽然增加消毒时间可以降低污染率，但处理时间过长，会对萌发造成影响。2%NaClO对文冠果茎段有一定的消毒作用，但消毒效果和萌发率都不如0.1%HgCl2，因此0.1%HgCl2更适合用于文冠果茎段消毒处理。

表1 不同消毒试剂的消毒效果

2.2 取材时期对外植体污染率和萌发率的影响

不同取材时期对外植体消毒和诱导影响很大，如图1所示，污染率在5月偏高，6、7月较低，8、9、10月逐渐上升，且外植体表面会有绒毛状菌丝，难以通过表面消毒而抑制细菌的滋生。而萌发率在5月较低，6、7月逐渐升高，且萌发的组培苗生长健壮；8、9、10月萌发率逐渐下降。因此，文冠果最好在6-7月采集茎段。

图1 不同取材时期对污染率及萌发率的影响

3 结 论

章古台地区春季风沙较大，导致长期暴露在野外的文冠果枝条表面有较多杂质和细菌，且茎段皮孔多，顶芽及腋芽周围滋生大量细菌，极易造成污染，且难以彻底消除，有的细菌甚至渗透到组织内部，因此文冠果茎段的灭菌处理成功与否会直接影响后续试验的成败。在文冠果组织培养时不仅选择消毒效果好的消毒试剂，还得掌握消毒时间，消毒时间短易造成灭菌不彻底，污染率高，而消毒时间过长，则会给外植体的生长造成损伤，影响诱导率。

本试验使用75%乙醇、0.1%HgCl2、2%NaClO对外植体进行消毒，设置不同灭菌时间，发现经过75%酒精20 s消毒2次，0.1%HgCl2消毒9 min，能有效降低污染率，获得较高萌发率，且获得的组培苗生长健壮。

除了消毒试剂和消毒时间对外植体污染的影响外，选择合适的采条时间也很重要。通常情况下，春季和夏季，天气晴朗，植株生长旺盛，外植体生长活性强，所携带的微生物相对较少，灭菌相对容易。而秋季茎段已木质化，植株的代谢活动也相对减弱，活力降低，自身携带的微生物也较多，污染率较高。试验发现，在6-7月份取材效果最好，不仅污染率低且组培苗生长状态好。