基于不同乳糖浓度的乳蛋白浓缩物发酵特性研究

罗天淇， 杨智杰， 张 敏， 王世杰， 朱 宏， 杨贞耐,*

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/北京市食品添加剂工程技术研究中心， 北京 100048； 2.石家庄君乐宝乳业有限公司， 河北 石家庄 050221)

乳蛋白浓缩物(milk protein concentrate，MPC)是一种采用膜分离技术生产的乳蛋白产品，其中酪蛋白和乳清蛋白的比例与原料乳相同[1]，具有优异的溶解性、乳化稳定性和热稳定性以及高蛋白、低乳糖的特点。

在发酵乳方面，MPC通过替代或额外添加的方式应用于牛乳中，可以降低体系乳糖含量，强化蛋白组成，促进发酵乳在生产过程中凝胶结构的形成，改善最终产品的品质。Rehman等[2]发现，使用MPC替代非脂肪干乳制备减脂切达干酪，干酪产量增加一倍，同时由于降低了干酪中乳糖残留量，能有效防止成熟过程中不良发酵的发生，减少肉汤味、苦味等异味的形成；添加MPC能够有效增强干酪的硬度和可切割性，但会降低干酪的融化性[3]；传统的酸奶质地较差且有乳清分离，在酸奶制作中添加MPC，可以作为稳定剂提高酸奶的质地[4]。康志远等[5]发现，适量添加MPC- 70替代牛奶可以明显改善酸奶的感官品质、稳定性以及质构特性；孙颜君[6]的研究显示，使用MPC强化酸奶可以提高黏度和持水性，并在感官上提高酸奶风味；此外，还可以利用MPC标准化原料乳降低乳糖含量来生产低乳糖酸奶[7]。

虽然MPC已经被广泛用于发酵乳生产中，但目前的研究重点都集中在MPC对发酵乳品质的改变上，而关于MPC自身发酵特性的相关研究少见报道。本研究使用MPC-70作为原料，在不同乳糖浓度下进行发酵，研究其发酵曲线、微流变、质构以及风味特性，以期为MPC在不同发酵乳制品中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MPC- 70(蛋白质70%、脂肪1.4%、乳糖16.2%)，宁夏塞尚乳业；乳糖，上海麦克林生化科技有限公司；发酵剂YO- MIX 300 LYO (保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)，丹麦Danisco公司。

1.2 仪器与设备

MLS- 3781L- PC型高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo公司； DHP- 9032型恒温培养箱，上海一恒仪器科技有限公司； iCinac型乳品发酵监控仪，法国AMS Alliance公司；Rheolaser Master型光学微流变仪，法国Formulaction公司；7890A- 7000型气相色谱- 质谱联用(GC- MS)仪，美国Agilent公司； CR 21GⅢ型高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；Brookfield CT3型质构仪，美国Brookfield公司。

1.3 实验方法

1.3.1基于不同乳糖浓度的MPC发酵样品制备

利用无离子水配制含45.0 g/L MPC- 70的混合液，其中乳糖质量浓度为7.3 g/L。进一步添加乳糖，至混合液中乳糖质量浓度为10.0、15.0、20.0、30.0、50.0 g/L。65 ℃下杀菌30 min，冷却至室温，加入商业发酵剂YO- MIX 300 LYO，42 ℃发酵5 h后冷却，置于4 ℃后熟24 h后进行相关指标的测定。

1.3.2发酵过程中的pH值测定

采用乳品发酵监控仪对发酵过程中pH值的变化进行监测，每1 min记录一次，持续10 h。

1.3.3发酵过程中微流变学参数测定

取接菌后的MPC溶液20 mL至微流变仪专用样品池中，将样品池插入微流变仪，运行测试程序。在42 ℃下监测发酵凝胶过程中的宏观黏性因子、弹性因子、固液平衡值以及流动性指数随时间的变化情况。每隔3 min采集一次数据，测定5 h。

1.3.4发酵样品的持水力测定

各组均称取10 g左右发酵乳样品，分别放于标号的离心管中并称量记录质量，4 000 r/min离心20 min，去上清液，称量并作记录，计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中：M0为空离心管质量，g；M1为样品质量，g；M2为样品离心除去上清液后的离心管与剩下样品总质量，g。

1.3.5发酵样品的质构分析

使用质构仪进行质构分析(texture profile analysis, TPA)，选用圆柱形TA10探头，目标值10.0 mm，测试速度0.5 mm/s。测定参数：硬度、黏力、弹性、胶着性。

1.3.6发酵样品挥发性风味物质测定

SPME法提取挥发性风味物质：萃取前将SPME纤维置于GC-MS进样口老化。取10 g发酵样品和1 μL内标物 2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，内标物质量浓度为0.816 μg/μL，加盖密封，在40 ℃恒温水浴下平衡30 min后，将SPME萃取纤维通过瓶盖插入样品中的顶空部分，推出纤维，顶空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS进样口解吸5 min，进行GC- MS分析。

GC条件：采用DB-wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色谱柱进行分析。升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升温到200 ℃，以10 ℃·min-1升至230 ℃，保持3 min，载气为氦气，流速1.2 mL·min-1，不分流进样。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z40～250 u。

定性分析：化合物通过NIST 14质谱数据库和文献报道的保留指数 RI值来鉴定。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮为内标物，采用内标法进行定量分析，求得各挥发性成分的含量。

1.4 数据处理

每个样品至少测定3次，实验数据采用SPSS 17.0软件进行分析，P<0.05表示差异显著；使用Sigma Plot软件绘图；风味物质用NIST14谱库检索，并应用CANOCO 4.5统计分析软件对风味数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 基于不同乳糖浓度的MPC发酵过程中pH值的变化

图1 发酵过程中的pH值变化Fig.1 pH changes of MPC during fermentation

使用乳品发酵监控仪对发酵过程中pH值的变化进行监测，实验结果如图1。由图1可知，6组实验样品的发酵pH曲线变化趋势相同，先下降后趋于平稳，但终止pH值不同。发酵前1 h，由于发酵剂中的乳酸菌进入新环境后有一定的延迟期[8]，各组pH 值下降比较缓慢。经过短暂的延迟期后，各组pH值快速下降至4.80左右，不同乳糖含量对发酵剂的产酸速率无明显影响。发酵5 h时，各组样品pH值陆续降至4.60，但不同乳糖含量的MPC发酵物的产酸速率开始出现差异；发酵10 h时，各组pH值依次为4.59、4.42、4.25、4.19、4.14、4.21。 乳酸菌利用乳糖的过程分为两个阶段，首先分泌乳糖酶将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，然后利用葡萄糖进行糖酵解产酸[9]，因此MPC发酵物的乳糖含量对乳酸菌发酵进入稳定期的时间与pH值有直接影响。乳糖质量浓度为7.3、10.0 g/L的两组样品pH值稳定在较高值，说明在发酵后期，由于这些样品中的乳糖含量过低，不足以让乳酸菌利用大量产酸[10]，因此使用MPC标准化原料乳降低乳糖浓度可以制备弱后酸化的低乳糖酸奶。

2.2 发酵过程中微流变学参数的变化

发酵是酸奶生产的重要阶段，在此过程中，随着pH值的降低，乳液中的微观结构发生改变，最终形成以酪蛋白胶粒为基础的凝胶结构，引起酸奶流变特性的显著变化[11-12]。微流变仪通过监测样品中粒子的运动，可以在不破坏样品的前提下研究样品流变特性[13]，基于不同乳糖浓度的发酵过程中流变学特性随时间的变化如图2至图5。图2至图5中，所有样品的弹性因子(EI)、宏观黏性因子(MVI)、固液平衡值和流动性指数变化趋势相同，但在发酵后期不同样品的流变学特性具体值存在一定差异。

弹性因子、宏观黏性因子作为时间的函数可以直接反映样品的弹性、黏性，弹性因子、宏观黏性因子越大，样品的黏弹性越强[14]。从图2、图3的黏度、弹性变化可以看出，各组样品发酵过程中的黏弹性变化可以分为3个阶段。在发酵前期，结合图1可知，发酵0～160 min，样品pH值由起始值降至5.30左右的过程中，样品处于低黏度、低弹性的液体状态，且无明显变化；而发酵160～200 min时，样品pH值由5.30 降至 5.00，乳蛋白开始凝胶化，黏度、弹性快速增加。Rohart等[15]研究葡萄糖酸-δ-内酯诱导的牛乳凝胶化发现，牛乳pH值在5.20～5.40时，其黏弹性出现类似变化趋势。Ercili-Cura等[16]认为这与酪蛋白胶束在pH值为5.00～5.50时引起的蛋白质聚集有关，当接近酪蛋白的等电点时，它们的溶解度降低，导致在pH值约5.00～5.20时的缔合和随后的聚集，从而引起牛乳性质的变化。之后，样品初步形成较为稳定的凝胶结构，黏性、弹性增长速度减缓，进入高黏弹性阶段，可能与形成的凝胶结构不稳定有关[17]。随着乳糖添加量的增加，各组样品宏观黏性因子降低，并且乳糖含量较低时变化明显(P<0.05)，而弹性因子在部分样品间存在显著性差异(P>0.05)，但整体上变化趋势不明显。

图2 发酵过程中的宏观黏性因子变化Fig.2 Macroscopic viscosity index of MPC during fermentation

图3 发酵过程中的弹性因子变化Fig.3 Elastic index of MPC during fermentation

固液平衡值(SLB)直接与样品黏弹性成正比，可以给出样品固液性质随时间的变化过程。当SLB=0时，样品为纯弹性/固体性质；0

图5 发酵过程中的流动性变化Fig.5 Fluidity index of MPC during fermentation

2.3 MPC发酵物的持水力及质构特性分析

表1是不同乳糖含量的MPC发酵物的持水力和质构特性分析结果。持水力是发酵乳品质高低的重要参数指标之一，它对延长发酵乳产品的货架期起着关键性作用。由表可知，随着乳糖添加量的增加，MPC发酵物的持水力逐渐升高，与Meletharayil等[20]关于乳糖添加量对MPC酸凝胶影响的研究结果相同。

TPA质构分析是2次咀嚼实验，可以模拟人类咀嚼食品，广泛用于固体、半固体食品的质构分析中[21]。表1所示质构特性中，弹性可用第一次压缩后样品回弹的高度表示，胶着性反映了使半固态样品破裂成吞咽时的分散状态所需的能量。MPC发酵物的胶着性、弹性随乳糖含量的升高，呈现先增大后减小的趋势，可能与凝胶过程中乳糖和酪蛋白分子之间相互作用有关[22]，而MPC发酵物的硬度、黏力随着乳糖浓度的增加无明显变化(P>0.05)。

表1 MPC发酵物的持水力与质构特性

同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 MPC发酵物的风味物质分析

2.4.1SPME-GC-MS 检测结果

风味是评估发酵乳品质的主要指标之一[23]。采用SPME-GC-MS技术从6组MPC发酵物样品中一共检测出29种挥发性风味物质，实验结果见表2。表2中包括烃类7种，醇类1种，醛类3种，酮类12种，酯类1种，酸类5种。

表2 MPC发酵物挥发性组分的定性定量分析

续表2 ng/g

定性方法中， MS 为质谱定性，RI为保留指数定性；“-”表示未检出；各物质的含量保留两位有效数字。

在发酵乳制品中，烃类物质大多来源于原料乳自身，这些物质阈值较高，对样品整体风味的贡献较小。在7种检出的烃类物质中，甲苯具有水果甜味[24]，王丹等[25]指出，甲苯是嗜热链球菌单菌发酵牛乳的关键挥发性物质之一，而苯乙烯被认为具有香醋味、橘香味[26]。

醛类是一类风味阈值偏低的风味物质，但由于醛类化合物化学性质比较活泼，在一定条件下易被还原成相应的醇，因此这类化合物在发酵乳制品中的含量通常都不高。GC-MS检测出样品中的3种醛类化合物中，壬醛具有青草味和霉腐味，其含量超过某个阈值时会产生令人不愉快的气味[27]；癸醛具有脂肪香气；苯甲醛具有杏仁、焦糖气味，可能与乳粉制作和牛乳杀菌时的美拉德反应有关。

酮类化合物在各组样品风味物质中含量较高，分别为挥发性风味物质总含量的41.06%、42.09%、46.01%、45.92%、48.80%、54.25%，一般认为酮类物质具有清香气味、奶油味和果香味[28]。在GC-MS检测出的15种酮类化合物中，2,3-丁二酮(双乙酰)、3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)被认为是影响发酵乳风味的关键因素[29]，并且随着乳糖含量的增加，在MPC发酵乳中的含量增加，验证了发酵乳中双乙酰、乙偶姻主要是由乳酸菌代谢乳糖而产生[30]。在其他酮类物质中，6-甲基-5-庚烯-2-酮具有蘑菇气味，2-壬酮、2-十一酮具有脂肪香，2-十三酮具有水果香、清香。

酸类化合物在各组样品中的含量较高，为25%～40%，但通常认为酸类物质在发酵乳制品中主要表现在滋味上，且阈值较高，对整体风味贡献小。乙酸具有醋酸味，丁酸具有奶油味，己酸具有强烈的腐臭奶酪香气，辛酸略有不舒适的气味，癸酸具有脂肪味。在酸类化合物含量上，随着乳糖含量的增加，MPC发酵物中的酸类挥发性化合物含量降低，可能是因为乳糖影响了风味物质与乳基质之间的相互作用。

2.4.2风味物质主成分分析

为了明确乳糖浓度对MPC发酵物风味的影响，利用主成分分析法考察了挥发性风味物质与样品间的分布关系，研究结果如图6。

图6 MPC发酵物风味的主成分分析结果Fig.6 Principal component analysis of flavor in MPC fermentation product

图6中，F1和F2的贡献率分别为50.9%、27.3%，可以很好地解释乳糖浓度对样品风味的影响。从图6可以看出，各组样品在主成分分析图中的分布比较分散，说明乳糖浓度对MPC发酵物风味物质的组成有较大影响。随着乳糖浓度的增加，不同风味物质对MPC发酵物的贡献也随之变化。不添加乳糖时，乙酸(24)对整体风味有较大贡献；而乳糖浓度达到30.0 g/L和50.0 g/L时，对整体风味有重要贡献的风味物质变成了2,3-丁二酮(12)、2,3-戊二酮(13)、2-庚酮(14)以及3-羟基-2-丁酮(16)等物质。在发酵乳中，乙酸主要来源于脂肪酸降解以及乳糖代谢[23]；2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-戊二酮均为乳酸菌代谢乳糖的产物[30]；2-庚酮与饱和脂肪酸的降解有关[31]，是发酵乳制品特征风味的重要组成物质。因此，乳糖浓度主要是通过影响乳糖代谢产物的形成改变MPC发酵物风味物质的组成，随着乳糖浓度的增加，乳糖代谢产物对整体风味的影响也随之增加。

3 结 论

本研究利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌复合发酵剂，探讨了不同乳糖浓度条件下乳蛋白浓缩物的发酵特性。随着乳糖质量浓度的升高(7.3～50.0 g/L)，MPC发酵物的发酵终点pH值呈下降趋势(pH值范围4.14～4.59)；同时，MPC发酵物的宏观黏性因子减小，固液平衡值、流动性指数增大，持水力逐渐升高，胶着性和弹性呈现出先增大后减小的趋势，而硬度和黏力不受影响。MPC发酵物中的挥发性化合物主要是酮类和酸类物质，其中酸类化合物含量随乳糖添加量的增加而减少，而2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮等乳糖代谢物的含量则随之增加。本研究旨在为进一步了解MPC的发酵特性及其在发酵乳制品中的应用奠定基础。