岩藻甾醇对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究△

杨 玲 郑超群 吴福珍 许燕丽（深圳市宝安区石岩人民医院妇产科 深圳 518108）

卵巢癌（ovarian carcinoma）是女性常见恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后不良。通过药物抑制肿瘤细胞的增殖、分化是主要的治疗策略。但很多药物使用后会导致细胞的耐药，因此寻找一种更有效的药物是治疗的关键[1]。岩藻甾醇是从褐藻中提取的一种成分。研究表明[2]岩藻甾醇具有抗肿瘤、抗氧化作用。Peroxiredoxins（Prxs）是近些年出现的抗氧化酶系，包括Prx I-Ⅵ[3]，PrxⅢ与众不同，在清除活性氧中发挥至关重要的作用。本研究探索岩藻甾醇是否通过靶向Prx III诱导卵巢癌细胞分化，为卵巢癌的诊治提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器：HO8910、HRA及SKOV细胞系（广东凯普生物科技公司）；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）（上海西泽斯生物公司）；RPMI-1640培养液（美国Sigma公司）；兔抗鼠PrxⅢ单克隆抗体、HRP标记的二抗（上海鼎国生物有限公司）；岩藻甾醇（象山康瑞达生物工程有限公司）（质量分数≥90%）；流式细胞计数仪、酶标仪SpectraMax M5（上海美谷分子）；倒置相差显微镜（上海美谷分子）；低温高速离心机（北京卓立汉光仪器有限公司）；SDS-PAGE凝胶电泳及转移装置（北京华夏科创仪器有限公司）；LAS400凝胶成像系统（德国凯沃生物公司）。

1.2 实验分组：取传代3次的细胞，细胞密度5×103/mL，取2 mL加入6孔板。对照组不加入药物，实验组分别为0.1 mmol/L岩藻甾醇组、0.2 mmol/L岩藻甾醇组、0.4 mmol/L岩藻甾醇组。每组3个复孔，37℃，5%CO2恒温培养箱进行培养。

1.3 细胞形态观察：取传代培养3代的细胞，接种于6孔板，加入不同浓度的岩藻甾醇。培养24、48、96 h后收集细胞，PBS洗涤，光学显微镜下观察细胞形态。

1.4 MTT检测细胞增殖能力：将各组细胞接种于96孔板，细胞浓度调整为5×103个/孔，培养48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h后酶标仪测量OD值。细胞生长抑制率（IC）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.5 流式细胞术测定细胞周期：各组细胞胰酶消化，离心，PBS洗涤3遍，离心，PBS重悬，室温培养1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗涤3遍，加入10 mL PI避光条件下4℃孵育1 h。流式细胞仪检测激发光Ex=488 nm处的荧光强度。

1.6 Western blot检测PrxⅢ蛋白量表达：小心吸去培养基，PBS洗涤细胞，裂解液裂解细胞，冰浴30 min，40℃ 1 500 r/min离心5 min，吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10 μL 待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭 1 h，逐次鼠抗人PrxⅢ多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗。Bio-Rad成像仪曝光成像，Image Lab Software测定光密度。

1.7 统计学方法：数据使用SPSS17.0软件处理，计量资料采用（±s）表示，行 t检验；计数资料使用（%）表示，行 χ2检验。P<0.05表示差异有统计意义。

2 结果

2.1 细胞形态学变化：对照组细胞多为类圆形或椭圆形，外表规整，成簇生长。经岩藻甾醇处理的细胞发生类圆形-星状-梭形的形态转变。0.4 mmol/L岩藻甾醇组的细胞在形态上发生明显改变，细胞密度也显著下降。见图1。

2.2 岩藻甾醇对细胞增殖、凋亡的影响：MTT结果显示，与对照组相比，岩藻甾醇降低了细胞增殖率，且呈浓度增加，增殖率越来越低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

流式细胞术结果表明，与对照组比较，加入岩藻甾醇后的细胞G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 3、表 1。

表1 各组不同周期细胞分布比较（%，±s）

表1 各组不同周期细胞分布比较（%，±s）

注：与对照组比较，* 为 P＜0.05。

组别 G 0/G 1期 S期对照组0.1 m m o l/L岩藻甾醇组0.2 m m o l/L岩藻甾醇组0.4 m m o l/L岩藻甾醇组5 9.3 6±2.3 0 7 5.3 9±3.8 4*8 1.9 3±1.7 3*8 8.0 3±2.1 5*2 7.0 4±1.3 2 4.0 5±1.4 4*3.8 5±0.6 4*2.5 4±0.6 4*

2.3 各组PrxⅢ蛋白量表达：Western blot结果显示，4组PrxⅢ蛋白量存在显著差异（F=18.053，P=0.000）。0.1 mmol/L岩藻甾醇组PrxⅢ蛋白量高于对照组，差异无统计学意义（t=0.827，P=0.133）；0.2 mmol/L岩藻甾醇组PrxⅢ蛋白量高于0.1 mmol/L岩藻甾醇组（t=2.326，P=0.032）；0.4 mmol/L岩藻甾醇组PrxⅢ蛋白量高于0.2 mmol/L岩藻甾醇组（t=7.923，P=0.014）。见图4。

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡是治疗恶性肿瘤的常用方法。但药物耐药性、有效性等问题给治疗带来了新课题[4]。因此，寻找一种新型药物及治疗靶点成为目前研究的热点。

研究表明，岩藻甾醇具有抗肿瘤、抗炎作用，能够诱导急性早幼粒性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）细胞分化。研究显示，岩藻甾醇具有较强的诱导急性早幼粒细胞白血病分化[5-6]。但是岩藻甾醇对于其他肿瘤的生物学效应研究还未见报道。毛正等[7]研究表明，岩藻甾醇可以显著抑制肺癌细胞的增殖。本研究结果显示，岩藻甾醇使卵巢癌细胞出现偏心细胞核，核浆比例减少等细胞分化表现。细胞生长和增殖失控是肿瘤的主要特征之一，细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为方面的异常均参与了肿瘤的发生发展[8-11]。细胞增殖与分化是由细胞周期中的G1期或G1/S期控制[12]。本研究结果显示，与对照组相比，岩藻甾醇组细胞增殖率降低，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，提示岩藻甾醇能诱导细胞增殖抑制并使细胞周期阻滞。

Prx III属于 Peroxiredoxins（Prxs）家族，存在于线粒体，在抗氧化、调节细胞内信号转导、细胞周期中起到至关重要的作用[13]。实验表明[14]，HeLa细胞中Prx III含量明显大于谷胱甘肽过氧化物酶（GPxl），提示Prx III为主要抗氧化酶。另有研究提示HeLa细胞Prx III含量与H2O2水平呈负相关[15-17]。目前对于岩藻甾醇与PrxⅢ的关系不详。本研究表明，岩藻甾醇组PrxⅢ水平高于对照组，且随着浓度的增加，PrxⅢ蛋白量越高，说明岩藻甾醇诱导卵巢癌低分化可能与PrxⅢ有关。

本研究也有不足之处，我们并未对其他靶基因与相关通路研究，今后我们对相关通路分析、验证，希望为卵巢癌的诊治提供思路。

总之，岩藻甾醇可诱导卵巢癌细胞的分化，其机制可能与Prx III有关，本次研究为卵巢癌的药物开发开辟新的思路。