噬菌体疗法及其在美洲幼虫腐臭病中的研究进展

董志祥， 罗智文， 张棋麟， 郭 军

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

植物大多是通过昆虫进行传粉的，而在传粉昆虫中，蜜蜂扮演了重要的角色，特别是西方蜜蜂(Apismellifera)，是全球范围内最具有经济价值的传粉昆虫[1]。然而，蜜蜂的生存受到了严重的威胁，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等，它们的出现给蜜蜂的健康造成了巨大的威胁。在小蜂螨(Tropilaclapsclareae)这一寄生虫未被发现之前，威胁蜜蜂最严重的细菌病是美洲幼虫腐臭病(American foulbrood disease，AFB)，现仍是蜜蜂中最严重的病害之一。在许多国家，AFB是需要呈报当地政府的疾病，其应对措施有相应的法律规定[2]。AFB是对养蜂业最具破坏性的一种细菌病，也是导致全球蜜蜂数量下降的主要原因之一[3]。AFB是因感染幼虫芽胞杆菌(Paenibacilluslarvae)而引起的，由工蜂从环境中携带进入蜂房，或者由同一蜂场的蜜蜂相互传染而引起[4]。当感染发生时，孢子萌发并杀死蜜蜂幼虫，导致幼虫液化，产生一种黏性的充满孢子的液体。这种疾病会在蜂房内迅速传播，如果不能及时进行有效的治疗，就可能导致整个蜂群崩溃[5]。现阶段通常使用氧四环素和酒石酸泰洛辛等抗生素来预防和治疗AFB感染。然而，抗生素的使用带来了更多严峻的问题，长期使用抗生素，导致许多野生型幼虫芽胞杆菌对氧四环素产生了耐药性[6-8]。此外，在2006年的一项研究中，采集的幼虫芽胞杆菌样品中有58%对氧四环素产生了耐药性[9],导致其疗效显著降低，不能有效地治疗AFB。同时，有文献报道了抗生素的使用破坏了蜜蜂肠道菌群的动态平衡，使感染真菌的风险增加，如微孢子虫[10]。因此，迫切需要加快对抗生素替代技术的研发，而噬菌体治疗作为抗生素的替代技术备受广大科研工作者的重视[11]。本文综述了噬菌体疗法的应用前景，并重点介绍了在美洲幼虫腐臭病中的研究，并且展望了今后的研究方向。

1 幼虫芽胞杆菌的致病机理

美洲幼虫腐臭病只发生在蜜蜂的幼虫阶段，AFB的病原体是幼虫芽胞杆菌(P.larvae)，为革兰阳性菌，其孢子能萌发为细菌[12]。其内生孢子生命极其顽强，是其传染的唯一形式，且对幼虫的传染性极强，但对成年工蜂却没有严重的危害[13]。刚刚孵化的蜜蜂幼虫最容易遭受感染，在孵化后的12～36 h内，幼虫因食用被P.larvae污染过的食物(大约只需要10个孢子)，即可诱发致命的感染[14-16]。Davidson等[17]的研究表明，营养型的孢子通过吞噬作用立即穿过中肠的上皮细胞，孢子萌发后主要在血腔增值。但Yue等[18]利用P.larvae的特异性16S rRNA探针，通过荧光原位杂交技术证明了Davidson等人的结论是错误的,并已证实营养型孢子寄生于中肠，并在中肠大量增殖，且没有破坏中肠组织的完整性。当幼虫受到P.larvae感染时，P.larvae以幼虫摄入的食物为食，并与幼虫以共生的方式存活。P.larvae通过糖酵解途径(Emden-Meyerhoff-Parnas，EMP途径)中的活性酶、磷酸戊糖途径以及与碳水化合物代谢相关的ED(Entner-Doudoroff，ED)途径，代谢葡萄糖、果糖等糖类，以获得生长所需的营养[19]。受到感染的幼虫，其腹膜后膜有助于保持中肠腔内的细菌数量，虽然P.larvae能穿透该保护层[18,20]，当幼虫肠道大量充满这些致病细菌时,在感染的后期则会攻击上皮细胞，使上皮细胞破裂。P.larvae通过细胞外间隙进入血腔，它们也在细胞外间隙生活(迁移和增殖)。在幼虫生长和感染的过程中，最明显的特征是分泌高度活跃的细胞外蛋白酶[21-23]。很容易推测，这些蛋白酶的作用可能是通过降解细胞-细胞或细胞-基质的连接结构从而破坏上皮细胞屏障的完整性，使P.larvae侵入血腔。P.larvae进一步需要分泌蛋白酶来降解被其侵染的幼虫，使幼虫变成棕色、半流体、胶状胶体(黏稠阶段)。这两种过程对P.larvae来说都至关重要，因为它必须在处于营养阶段以某种方式逃离幼虫的外壳，以确保孢子形成后能够自由进出，以便在蜂群中传播，并被下一个宿主吞食。被侵染的幼虫逐渐干燥，就像“鳞片”一样紧紧附着在细胞壁上。这些“鳞片”含有数以百万计的孢子，具有较强传染性，这些孢子使AFB在蜂群内部和蜂群间传播[24-25]。孢子的感染能力可持续35年之久，并且能够抵抗高温、高寒、高湿的环境。正是由于孢子极强的抗逆性以及患病蜂群中存在极高数量的孢子，导致AFB的预防及治疗变得异常困难。到目前为止，AFB已经被认为是蜜蜂中最致命的病害之一，其不仅在群体内水平传播，更严重的是还能在群体之间垂直传播[26]，所以预防及治疗AFB的新技术迫在眉睫。

2 噬菌体疗法

2.1 噬菌体疗法概述

自抗生素被发现以来，由于滥用，导致了细菌产生耐药性并不断漫延[27]。耐药菌的出现不仅危害动植物健康[28]，而且目前还没有有效的手段对其导致的感染进行治疗，烈性噬菌体具有代替抗生素的潜力。这使得更多相关的研究者关注噬菌体疗法。噬菌体是感染细菌的病毒，只要细菌宿主存在，它便存在于任何环境中，在许多生命过程中扮演着重要的角色，被看做是地球上最丰富的生物[29]。大多数噬菌体(目前已经确定的96%)按照以下分类方法进行分类，有尾噬菌体目有尾且含有双链DNA分子，在同一家族中进一步分为长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科和短尾噬菌体科[30]。

与抗生素相比，噬菌体疗法的优势在于具有在宿主菌体内增殖的能力[31-32]，且具有高度的专一性，只对少数菌株有裂解活性[33]，因此它们对环境中的共生微生物群是无害的[34]，且噬菌体只有在宿主存在时才能存活，当所有宿主都被裂解后，噬菌体就会自动被清除[35]。噬菌体的使用方法也比较多样，既可以使用单一噬菌体，还可以和其他噬菌体混合使用以扩大裂解范围[11]。此外，噬菌体可以根据不断进化的细菌对自身进行修饰，从而继续感染和裂解病原菌，并具有裂解耐药菌的能力[36]。

2.2 噬菌体制剂的选择与制备

噬菌体疗法与抗生素的抑菌效果相比，其应用价值被低估了，主要原因是噬菌体制剂的选择、制备以及储存不当[37-38]。噬菌体来源广泛，根据治疗目的，可从与病原体相关的环境中分离相对应噬菌体，污水可能是最丰富的噬菌体来源[39]。对于与医院环境或与临床相关的病原菌来说，与其环境直接接触的废水或污水中更容易分离得到噬菌体[40]。从技术角度上讲，分离噬菌体最直接的方法是双层琼脂法，将环境样品与宿主菌按照不同比例在半固体培养基中混合，然后将其置于宿主菌株选择性培养基内，鉴定是否形成噬菌斑，该噬菌斑即是宿主相对应的噬菌体[37]。噬菌体对不同的细菌菌株敏感性可能不一样，因此，可以通过增加噬菌体制剂侵染宿主的范围提高其治疗效率[41]。此外，为了扩大噬菌体疗法的裂解谱，可将多种噬菌体制剂混合，称之为噬菌体鸡尾酒[42]。噬菌体在给药部位的存活率对疗效十分重要，为解决这一难题，可通过选择裂解周期长的噬菌体或者通过修饰噬菌体的免疫原性来减少它们被网状内皮系统细胞的清除作用[41]。

为了保证噬菌体疗法的安全性，任何噬菌体治疗产品都必须按照药品生产质量管理规范(GMP)生产，其相关规则对生产过程(灭菌和纯化)的要求非常严格。因此，有必要对噬菌体裂解物进行过滤和离心，以便将噬菌体纯化。对于革兰阴性菌的溶出物，需要更彻底地纯化来去除细菌内毒素。此外，在使用管理应用程序时，需要更加严格的净化过程[43]。一旦生产，噬菌体制剂应妥善储存。噬菌体由蛋白质组成，因此容易受到高温、pH、有机化合物等因素影响，随着包装技术的发展，噬菌体的储存技术也得到了很好地改善[44]。为保证噬菌体疗法的有效性，噬菌体必须被运送到理想的作用位点并保持较长时间的治疗水平。噬菌体有多种给药方式，包括肠内、外用、吸入或注射等，肠内给药是目前最常见的一种方式[45]。每个病原菌细胞大约需要10个或更多噬菌体病毒侵染，考虑到这一点，需要噬菌体滴度达到108/mL，才能使病原菌数量显著降低，尽管这个估计并没有考虑感染部位噬菌体的自我复制[46]。当前噬菌体治疗产品的药物调节通路尚不清楚，需要一个适应的框架才能将噬菌体治疗推上一个新的台阶[47]。

2.3 噬菌体治疗的安全性和有效性

关于噬菌体疗法的安全性，普遍观点认为使用是安全的，主要根据它们在环境中广泛存在的性质和我们不断接触到它们的事实，此外，并没有相关有害事件的报道。尽管噬菌体疗法的有效性报道屡见不鲜，但其使用的安全性也必须通过现代科学实验来验证[48]。噬菌体的安全性问题可以归结为对机体组织和其他非靶向微生物群的影响，它们能够具有通过表达毒性基因或通过在细菌之间转导DNA来改变细菌靶点的能力，以及诱导免疫反应的潜力[49]。另一个有关噬菌体疗法的安全性和有效性的重要问题是机体组织对噬菌体治疗的免疫反应，这包括适应性和先天免疫反应[50]，但并没有关于噬菌体治疗引起过敏反应的报道[49,51]。此外，噬菌体在生产过程中还有可能产生内毒素，可以通过过滤纯化得到噬菌体纯溶液。噬菌体是具有高度特异性的病毒，对正常的肠道菌群影响极小，因为它们通常只裂解一种细菌的少数菌株[52]。迄今噬菌体治疗已进行了少量的I，II期临床试验，Vandenheuvel等[53]在一篇综述文章中指出，噬菌体疗法并没有带来明显的不良反应。所以，噬菌体治疗的安全性得到了有利的证明。

噬菌体治疗的实施还面临着另一个严峻的问题，即噬菌体制剂的生产过程，因为相比抗生素相关产品的监管规则而言，对噬菌体制剂的要求似乎更严格[54]。Goman等[55]的研究表明，对抗生素产生强耐药性的细菌，噬菌体能够通过裂解宿主菌而有效的抑制其生长。由于耐甲氧西林和万古霉素的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的出现，使抗生素治疗效果越来越差，幸运的是，不断有新的临床证据支持噬菌体疗法用于对抗人类严重的金黄色葡萄球菌感染是安全有效的[40]，如噬菌体φ812，它能够以沙门氏菌为宿主菌进行裂解[56]。目前，抗生素的滥用已导致其疗效越来越差，而新的抗菌药物研发缓慢，因此，对噬菌体治疗相关产品的开发显得尤为重要[57-58]。

2.4 噬菌体疗法的相关研究

噬菌体作为细菌的“寄生虫”，在动植物的安全与健康中发挥着重要的作用。金黄色葡萄球菌是奶牛感染乳腺炎的主要病原菌之一，牛乳腺炎给奶农造成了严重的经济损失。Ganaie等[59]使用SAJK-IND和MSP两种噬菌体的混合液显著抑制了金黄色葡萄球菌的生长，为奶牛牛乳腺炎的治疗带来了希望。导致食源性疾病感染和爆发的主要原因是沙门氏菌污染新鲜农产品，Bai等[60]利用噬菌体鸡尾酒(BSPM4,BSP101和BSP22A)作为天然的抗菌剂控制食源性病原体。Abedon等人通过小鼠感染亚胺硫霉素建立耐药败血症模型，结果表明在小鼠中即使延迟给药3 h，腹腔内注射噬菌体[46]都可以挽救小鼠的败血症[61]。此外，Watanabe等[62]指出噬菌体疗法可以显著降低铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)引起的小鼠肠源性脓毒症的发病率。在小鼠模型中，应用噬菌体滴眼液，通过去除铜绿假单胞菌治疗铜绿假单胞菌性角膜炎，效果显著[63]。在小鼠烧伤模型中，噬菌体的局部应用已被证明是治疗肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)感染的有效方法[64]。类似结果也出现在革兰阳性菌的研究中，例如噬菌体疗法对小鼠粪便中万古霉素耐药屎肠球菌(Enterococcusfaecium)[65]、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的败血症模型也表现出较好的治疗效果[66]。同样，噬菌体治疗金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的研究表明，动物模型在感染和预防脓肿形成方面显示出积极的效果[67]，防治败血症和慢性骨髓炎也有显著的作用[68-70]。噬菌体疗法在动、植物的细菌性疾病中已得到广泛的应用，表1列出最近噬菌体在治疗各类细菌病中取得的研究进展。

表1 噬菌体疗法在各种病原菌中的应用

2.5 噬菌体疗法在美洲幼虫腐臭病防治中的应用

美洲幼虫腐臭病是蜜蜂中最严重的细菌病之一，防止病原菌P.larvae的感染是治疗这一病害的关键[3]。目前，利用噬菌体治疗美洲幼虫腐臭病取得了较大的进展，已分离的部分噬菌体对幼虫芽胞杆菌具有一定的裂解能力[79]。Brady等[80]于野外分离了59株P.larvae，用实验室分离的39株噬菌体去侵染这些P.larvae，选择3株裂解能力最强的噬菌体混合并在蜂箱中进行实验。结果表明，噬菌体混合液能够预防并治疗美洲幼虫腐臭病，困扰大家多年的AFB问题终于得到了初步的解决。这也是继抗生素之后最有效的治疗美洲幼虫腐臭病的手段，也是安全性最高、对蜜蜂伤害最小的治疗方法。在噬菌体治疗未引入AFB的治疗与预防之前，只能使用传统的抗生素进行治疗，随着细菌耐药性的增加，治疗效果不断降低，已不能有效地控制AFB的传染及扩散；此外，抗生素对蜜蜂危害极其严重，会导致蜜蜂肠道菌群紊乱，致使蜜蜂群势不断下降[10]。因此，噬菌体在AFB中的应用具有重要意义，不仅能够控制该细菌病的扩散与爆发，还能从根本上解决耐药性问题；同时，对蜜蜂中其他细菌病的预防及控制也有重要的指导意义，例如蜜蜂中的副伤寒疾病也有了新的防控方法[81]。欧洲幼虫腐臭病是我国东方蜜蜂中最严重的细菌病，发病比较普遍，而西方蜂种较少发生[82]，目前还没有噬菌体疗法在欧洲幼虫腐臭病中应用的报道，由于噬菌体疗法的安全性及高效性，采用噬菌体疗法治疗各类蜜蜂细菌病将是一个新的研究方向。

3 展 望

噬菌体作为传统抗生素的替代品，用于预防或治疗美洲幼虫腐臭病已经得到了证实[80]。为替代抗生素，广泛使用噬菌体治疗AFB打下了坚实的基础。越来越多的报道证明了噬菌体疗法具有特异性强、抑菌效果显著的特点，然而在蜜蜂及其他重要经济昆虫中的应用研究还比较少，研究较多的主要集中在哺乳动物中病原菌的防治与应用上。Brady等[80]在蜜蜂AFB的预防和治疗研究中，采用噬菌体疗法大大推进了这一技术在传粉昆虫中的应用，并为今后的害虫防治提供了新的思路。但目前这一技术还停留在实验室阶段，要在全球养蜂行业中得到推广还需要克服一些技术上的难题。

Brady等[80]将噬菌体混合液直接加入蜜蜂的饲喂盒中，以达到预防及治疗的目的。由于噬菌体本身也是蛋白质，随着时间的推移，其裂解活性、浓度都会有所下降，而噬菌体的滴度只有达到108，才能达到最好的裂解效果[46]。所以噬菌体的保存方法、包装、运输条件，以及给药剂型都需要重新设计，以达到噬菌体治疗的最大效率[44]。噬菌体侵入宿主细胞后，会表达出裂解酶，裂解细菌细胞壁，尤其对革兰阳性菌的裂解效果最佳。P.larvae是革兰阳性菌，但目前未见噬菌体裂解酶预防及治疗AFB的文献报道，但很多研究已证实了裂解酶的裂解效果，如噬菌体LKA1尾尖的特异性多糖裂解酶可降低假单胞菌的毒性[83]。因此，可以利用工程菌表达出对P.larvae有裂解活性的裂解酶，不仅抑菌效果显著，其储存方式和使用方法也简单方便，这也将是一个新的治疗领域与研究方向。

噬菌体治疗受到广泛关注的另一个原因是其高度的特异性，与广谱杀菌的抗生素相比，它仅仅只针对其裂解的病原菌，对肠道内的益生菌并没有危害。当蜂场感染AFB时，抗生素不能有效治愈，必须烧掉蜂箱，以防止继续扩散。这给蜂农造成了严重的经济损失，替代传统抗生素的技术急需尽快研发。噬菌体作为抗生素最好的替代品，在蜜蜂AFB中的使用已经初见成效，但其裂解谱较窄，使用的方法复杂。此外，其储存及其运输方式还需要深入研究。在蜜蜂中，还有许多其他危害蜜蜂的病原菌，也同样可以筛选出相对应的噬菌体进行治疗。

随着抗生素疗效的不断降低及导致的副作用越来越多，人们对噬菌体疗法又产生了浓厚的兴趣[84]。利用噬菌体对病原菌高度专一的裂解性，不仅可以有效地控制病原菌带来的危害，还降低了使用风险。但大多噬菌体的研究都是关于治疗动物的病原体，如静脉注射SH-Ab15519噬菌体成功治疗Acinetobacterbaumannii导致的小鼠肺部感染[85]，Jończyk等[86]利用噬菌体成功治疗Propionibacteriumacnes引起的痤疮，此外，Jamal 等和 Leskinen 等成功利用噬菌体裂解了铜绿假单胞杆菌[87]和金黄色葡萄球[88]菌。这些研究显示出噬菌体疗法治疗病原菌的优势，但其在昆虫中，特别是在重要的经济昆虫蜜蜂中的应用并不多见。虽然Brady等[80]应用噬菌体成功预防和治疗了AFB，但在噬菌体制剂，保存时间、用法用量等方面并没有进行深入研究，还无法在蜜蜂养殖的实际中应用。因此在今后的研究中，这些将成为研究的重点。随着研究的深入，噬菌体疗法作为高效、专一的抗生素替代品会有广阔的应用前景。