瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化

刘思佳， 赵圣国， 郑 楠， 王加启

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养国家重点实验室，北京 100193)

反刍动物瘤胃是一个复杂的生态系统，具有高度竞争的复杂微生物群落，对动物的健康有重要的影响[1]。瘤胃中微生物菌群主要有细菌、真菌、古菌、原虫、病毒和噬菌体等[2-3]。许多微生物紧紧地附着在瘤胃内容物上[4]并可以分泌生物降解酶[5]。反刍动物摄取饲料，进入瘤胃后，微生物降解、发酵产生的代谢物供宿主利用[6]，这些微生物在宿主的营养[7](如饲料和消化)、生理和免疫功能[8]方面发挥着重要作用。因此，研究反刍动物瘤胃中微生物菌群变化及其影响，对于反刍动物健康与产品品质调控具有重要意义。目前，瘤胃微生物群落的研究主要是描述其多样性，而对群落功能和代谢的研究仅限于可培养微生物[9]。但是，瘤胃中大部分微生物是无法进行分离培养的[10]。某些微生物生长过程需要共培养细菌产生的信号和化学因子的刺激[11]，因此，研究瘤胃微生物群落的主要挑战是缺乏适宜分离和培养技术[12]，并且能被培养的小部分微生物不能够代表微生态的多样性。宏基因组测序技术的发展克服了体外分离培养的困难，解决了纯培养难题，使得对复杂微生物群落的研究成为可能[13]。宏基因组学已经明显增加了对于微生物多样性的了解，为瘤胃微生物群落结构解析提供了重要技术支撑[14]，但该技术在揭示活性微生物群落能力方面存在重要缺陷[15]。通过基于DNA的方法可以成功地识别微生物种类与基因，但鉴定的一些微生物可能已经死亡或处于代谢失活的状态[16]，无法区分识别实际负责代谢的微生物。Gomez-Silvan等[17]在测定厌氧消化池中厌氧消化过程中观察到，RNA测序结果中古细菌显示出更高的多样性，但DNA测序结果中细菌显示出更高的多样性，β多样性分析显示微生物DNA和RNA测序结果之间的群落组成存在显着差异。宏基因组学可描绘特定环境中微生物群落的遗传基因蓝图，但转录组学可鉴定在某些生理条件下具有表达活性的微生物及其功能基因[18]。为了描述微生物群落中具有代谢活性的成员，基于RNA的群落分析更合适，因为细胞产生的RNA的量与细菌的生长活性直接相关[19]，RNA尤其是mRNA更能代表具有活性的细胞或具有代谢活性的细胞信息[17]。因此，用宏转录组学的方法来测定活性微生物群落信息，获得微生物之间潜在的协作关系并进行功能分析，对反刍动物瘤胃微生物发酵调控具有重要意义。但是，这一方法最重要的前提条件需要高效的、高质量的RNA提取技术。RNA非常不稳定，很容易被细胞内或环境中的RNA酶降解，因此从样本中提取高质量的RNA比提取DNA困难得多。瘤胃内容物成分复杂，微生物种类繁多，彼此之间又形成了紧密的合作共生关系[20]，在RNA 提取方法中对样品处理至关重要，有待于进一步优化改良。本研究目的是优化RNA提取过程中瘤胃液前处理方法，提高瘤胃微生物RNA数量与质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液采集 采集1头瘘管荷斯坦奶牛(550±23) kg 瘤胃液，奶牛日粮组成：苜蓿干草17.3%，玉米青贮18.7%，豆粕11.3%，菜粕4.2%，棉粕2.1%，膨化大豆2.1%，甜菜渣4.2%，全棉籽10.4%，玉米25.6%，食盐0.5%，预混料3.6%。

1.1.2 主要试剂及仪器 液氮，RNA 保护液(Invitrogen)，三氯甲烷(北京试剂)，异丙醇(北京试剂)，无水乙醇(北京试剂)，RNase-Free 水(TIANGEN)；液氮冷冻研磨仪(Retsdi-Alleel-5,CryoMill,Retsch Gmbll)，Trizol(Invitrogen)，高通量组织研磨仪 (Retsch, Haan,TL2020)，安捷伦2100生物分析仪(2100,Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, 加拿大),RNA 6000纳米试剂盒(Agilent Technologies),水浴锅(Thermomixer comfort,EPPENDORE),离心机(3-18K，Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液前处理 瘤胃液经6层纱布过滤去除固体饲料颗粒，进行3种不同的处理：①取过滤后的瘤胃液24 mL(每管4 mL,共6管)迅速置于液氮中冷冻保存；②将过滤后的瘤胃液离心(12 000×g,5 min)，弃上清，收集瘤胃菌体，迅速置于液氮中冷冻保存；③取离心后瘤胃菌体加入5倍体积RNA保护液，将瘤胃菌体重悬，常温保存。将液氮中冷冻保存的瘤胃液置于室温下进行解冻，解冻后离心(12 000×g,5 min)，弃上清收集瘤胃菌体。将加入RNA 保护液的样品离心(12 000×g,5 min)，弃上清收集瘤胃菌体。将液氮冷冻保存的瘤胃菌体、液氮冷冻保存的瘤胃液、解冻离心后收集的菌体和RNA保护液离心收集的菌体，利用液氮冷冻研磨仪进行破碎，(研磨破碎样品时，整个过程中样品要一直处于液氮环境下)，条件为加入1颗20 mm钢珠和10颗5 mm钢珠，研磨5 min后立刻加入5 mL Trizol,充分混匀进行下一步试验。取液氮冷冻保存的瘤胃菌体，加入5 mL Trizol后利用高通量组织研磨仪常温研磨，振动频率1 800/min，研磨60 s。 试验共优化4个前处理条件，组合形成5个试验处理组(A、B、C、D、E)，见表1。

表1 瘤胃液样品前处理方法

1.2.2 总RNA提取与质量评定 加入Trizol的样品在室温放置5 min，添加总体积0.2倍体积的三氯甲烷，涡旋混匀15 s，室温放置3 min，离心(12 000×g,4 ℃,15 min)，取上层水相到新的离心管中，并添加与上层水相等量的冰异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10 min，或-20 ℃放置1 h后离心(12 000×g,4 ℃,15 min)。倒出上清，添加与异丙醇等量的冰75%乙醇(75%乙醇使 用RNase-Free水配制，此试剂要现配现用)，轻轻将整块沉淀吹起悬浮(此处千万注意不要将 RNA沉淀吹散，因为RNA吹散后很难通过离心重新聚集在一起)，离心(7 500×g,4 ℃, 10 min)，弃乙醇溶液。室温放置5～10 min，直至干燥。加入没有RNA酶的水 100 μL(可根据需要增加或减小体积)，水浴(55～60 ℃)加热10～15 min使RNA更好地溶解。使用安捷伦2100生物分析仪和RNA 6000纳米试剂盒评估RNA浓度和完整性。

1.2.3 数据统计分析 利用SAS方差分析法对RNA 浓度和完整度进行差异统计分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA浓度

液氮环境下冷冻研磨破碎瘤胃菌体、瘤胃液和解冻后收集的瘤胃菌体，总RNA的浓度分别为783.67、773、1 048 ng/μL，差异不显著(P>0.05)(图1)。对比处理组B和E，瘤胃液样品形式对RNA浓度影响没有显著差异(P>0.05)。对比处理组A和B，添加RNA保护液在冷冻研磨条件下得到的RNA浓度为65 ng/μL。液氮保存的样品比RNA保护液保存的样品提取的RNA浓度高91.8%，显著高于RNA保护液保存的方式(P<0.05)。保存形式对RNA浓度影响有显著差异(P<0.05)。对比处理组D和E，说明解冻处理对RNA浓度影响没有显著差异。对比处理组B和C，瘤胃菌体在常温环境下研磨得到的RNA浓度为418.67 ng/μL。冷冻研磨比常温研磨提取RNA浓度高46.6%，显著高于常温研磨的方法(P<0.05)。研磨温度对RNA浓度影响有显著差异。

图1 瘤胃液不同前处理条件对总RNA 浓度的影响Fig.1 Effect of different pretreatment conditionson total RNA concentration

A:微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨; B:微生物菌体液氮保存冷冻研磨; C:微生物菌体液氮保存常温研磨; D:瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨; E:瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a～c字母不同表示差异显著(P<0.05)

A：Freeze homogenization of Bacteria with RNA Protective Solution；B：Freeze homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；C：Room temperature homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；D：Liquid nitrogen and homogenization of rumen contents after liquid nitrogen storage and thawing；E：Freeze homogenization of rumen contents with liquid nitrogen, Significant difference in different representations of a-c letters (P<0.05)

2.2 总RNA完整度

对比处理组B和E，液氮环境下冷冻研磨破碎瘤胃菌体和瘤胃内容物，总RNA RIN值分别为8.4 和9.4，差异不显著(P>0.05)(图2)。处理瘤胃液样品形式对RNA完整度影响差异不显著。对比处理组A和B，添加RNA保护液提取总RNA RIN值为2.8。液氮保存的样品提取RNA完整度极显著高于液氮保存的样品(P<0.05)。处理保存形式对RNA完整度影响极显著。对比处理组D和E，解冻后收集菌体提取RNA RIN值为 5.5。不解冻处理所提取的RNA完整度(P<0.05)显著高于解冻处理，解冻处理对RNA完整度影响有显著差异。对比处理组B和C，分别在常温和液氮环境下破碎瘤胃菌体，RNA RIN值分别为8.4和8.3，差异不显著(P> 0.05)，研磨温度对RNA完整度影响差异不显著。

图2 瘤胃液不同前处理条件对总RNA 完整度的影响Fig.2 Effects of different pretreatment conditions on the integrity of total RNA A：微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨；B：微生物菌体液氮保存冷冻研磨；C：微生物菌体液氮保存常温研磨；D：瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨；E：瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a～d字母不同表示差异显著(P<0.05)A：Freeze homogenization of Bacteria with RNA Protective Solution；B：Freeze homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；C：Room temperature homogenization of Bacteria with liquid nitrogen；D：Liquid nitrogen and homogenization of rumen contents after liquid nitrogen storage and thawing；E：Freeze homogenization of rumen contents with liquid nitrogen, Significant difference in different representations of a-d letters (P< 0.05)

3 讨 论

浓度和完整度是评价RNA的两个重要指标。RIN值用来评估RNA的完整性，它是由核糖体条带的比值和RNA样品的整个电泳轨迹决定的[21]。RIN值为10表示一个完整的RNA样本，RIN值大于8的样本符合转录组文库构建要求，可进行下游试验[22]。环境或胃肠道样品的RNA很容易被RNA酶降解，它的提取是一项具有挑战性的任务。RNA酶广泛而稳定存在，耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌。在实验中，要严格控制外源RNA酶的污染，同时也要最大限度地抑制内源性RNA酶。本研究描述了不同的瘤胃液前处理方法对提取RNA浓度与完整度的影响，找到了一种分离提取高质量、高代表性的瘤胃微生物RNA的快速有效方法。

本研究发现收集瘤胃内容物或瘤胃微生物菌体得到的RNA浓度和完整度都没有显著差异。但是采集瘤胃微生物菌体需要采样现场配置离心机，一方面氧气可能导致厌氧微生物死亡，另一方面增加了采样的难度。与本研究类似的是Poulseny等[23]在研究奶牛瘤胃中产甲烷菌时，利用直接将瘤胃内容物于液氮中速冻的前处理方法。

本研究中解冻处理对RNA浓度影响没有显著差异,但是不解冻处理提取的RNA完整度显著高于解冻处理RNA，这可能是由于解冻后，RNA酶恢复活性降解RNA降低了完整度。Dai等[24]提取瘤胃内容物与瘤胃中未消化的纤维RNA时，利用将采集的样品置于液氮速冻并保存的前处理方法。Shinkai等[25]分别提取瘤胃固相和瘤胃液相RNA时，利用将样品直接在-80 ℃储存的前处理方法。该处理与本研究所得结论一致。

RNA保护液是一种液态、无毒的组织保存试剂，可以防止RNA的降解。本研究中提取液氮冷冻保存的样品所得RNA浓度和完整度均显著高于由RNA保护液保存的样品。出现这种差异的原因可能是RNA保护液具有偏好性。Xiang等[26]在提取瘤胃壁组织中的RNA时，将瘤胃壁组织样品保存在RNA保护液中，提取RNA平均浓度为(333.9±143.4) (SD) ng/μL。Comtet-Marre等[27]提取瘤胃内容物中的RNA时，将采集的瘤胃内容物样品与RNA保护液混合，带回实验室经过离心处理后-80 ℃储存，提取RNA的RIN值为9.4。在Mayte等[28]、Jiao等[29]和Schwab等[30]的研究中，皮肤与血清样本、肠道黏膜样品和小鼠肠道内容物样品均保存在液氮中。因此，瘤胃内容物成分复杂，尽量对样品进行液氮速冻，如果确实没有速冻条件，可以用RNA保护液，但需要回实验室后尽快低温冻存。

研磨温度对RNA浓度有显著影响，但对RNA完整度影响不显著。将样品与TRIzol试剂混合，通过室温珠磨破碎的方法，有效地裂解了瘤胃微生物。冷冻研磨的方法分离提取的总RNA浓度显著高于室温研磨的方法。TRIzol试剂可以抑制RNA酶的活性，保护微生物RNA的完整性，但瘤胃微生物未破裂前在室温环境下，内源RNA酶恢复活性降低了RNA浓度。低温可以抑制微生物和核糖核酸酶的活性[31]。 Li等[32]、Tveit等[31]和Dai等[24]在提取RNA过程中，肝脏样品和瘤胃壁样品，泥炭块和瘤胃内容物均采用液氮冷冻研磨的方法进行破碎。与本研究结果一致，认为在液氮环境下冷冻研磨破碎瘤胃微生物是RNA提取的关键技术之一。

提取得到高质量的瘤胃微生物RNA后，由于溶液中包含有gDNA、rRNA和一些无机离子物质，并且RNA非常不稳定，需要做进一步的纯化和反转录处理。使用DNase酶去除gDNA，结合RNA纯化试剂盒去除DNase酶、rRNA和无机离子物质，得到高纯度的RNA，之后转录得到稳定的cDNA或直接对mRNA进行测序[33]。宏转录组学是一个快速发展的领域[18]，已显示出相当大的潜力[34]。我们的方法使获得大量高质量的RNA成为现实。对于瘤胃环境，该方法可用于研究微生物群落、日粮组成以及其他因素对瘤胃功能和基因表达的影响。

直接采集瘤胃内容物后,液氮速冻并在不解冻处理条件下冷冻研磨的方法，所提取的RNA完整度和浓度较好，可用于后续宏转录组学试验。