五痹汤对大鼠佐剂性关节炎的疗效及肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平的影响

徐子涵，商玮，赵智明，沈俊逸，刘春丽，蔡辉

作者单位：东部战区总医院中西医结合科，江苏 南京210002

类风湿关节炎（类风关）是一种慢性炎症性自身免疫疾病，以小关节滑膜异常增殖、血管翳形成与骨侵蚀为其主要病理特点［1］。类风关常见关节屈伸不利、红肿焮热，肌肉酸楚疼痛、麻木不仁，属中医“痹症”范畴［2］。五痹汤是中医治疗痹症的名方，出自于《太平惠民和剂局方》，书中记载：“五痹汤，治风寒湿邪，客留肌体，手足缓弱，麻痹不仁；或气血失顺，痹滞不仁，并皆治之。”［3］本方以筋骨酸痛，更以上肢肩臂为甚、举动不便为辨证要点。佐剂性关节炎大鼠模型是研究类风关的主要动物模型之一［4］。本研究于2017年3—5月通过观察五痹汤对佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀度、关节炎症、踝关节病理及关节滑液肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）水平的影响，探讨五痹汤对大鼠佐剂性关节炎的治疗效果及潜在机制，在动物实验层面为五痹汤治疗类风关提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠40只，周龄范围为8～10周，体质量范围为160～180 g，由东部战区总医院实验动物中心提供，医学实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2017-0003，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2药品与试剂五痹汤浓缩液：由姜黄15 g、羌活15 g、白术15 g、防己15 g，炙甘草6 g组成，东部战区总医院制剂科配制成浓缩液，每克含生药量1.32 g。甲氨蝶呤混悬液：甲氨蝶呤片（上海信谊药厂有限公司，生产批号170113）研呈细末，与0.9%氯化钠溶液配制成甲氨蝶呤混悬液，浓度为0.1 mg/mL。TNF-α试剂盒（武汉博士德生物技术公司，生产批号BA1205），IL-1β试剂盒（武汉博士德生物技术公司，生产批号BA1122），弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，生产批号160811）。

1.3佐剂性关节炎大鼠模型的制备将大鼠固定后剔除尾根部毛发，75%乙醇消毒，于尾根部皮下注射0.1 mL弗氏完全佐剂，建成佐剂性关节炎大鼠模型［5］。

1.4分组与干预按照随机数字表法将大鼠分为四组（每组各10只）：健康组、模型组、五痹汤组和甲氨蝶呤组。健康组大鼠于尾根部皮下注射0.1 mL 0.9%氯化钠溶液，其余三组均制备佐剂性关节炎大鼠模型。造模9 d后，健康组和模型组以0.9%氯化钠溶液2毫升/只灌胃。参照“人与动物体表面积计算法”制定给药剂量，五痹汤组以五痹汤浓缩液6 g·kg-1·d-1灌胃，甲氨蝶呤组每周予以甲氨蝶呤混悬液1 mg/kg灌胃，未用药的实验日给予0.9%氯化钠溶液2毫升/只灌胃，各组均连续灌胃14 d。

1.5测定足爪肿胀度致炎前用足容积测量仪测量每只大鼠右后足容积，从炎症出现后，每隔3天（d9、d12、d15、d18、d21、d23）测量右后足容积，足爪肿胀度结果用△mL＝|注射后的足爪容积-注射前的足爪容积|［6］。

1.6关节炎症程度的评估从炎症出现后，分别于d9、d12、d15、d18、d21、d23进行关节炎指数（arthritis index，AI）评分，评定关节炎程度（0～4分）。0分：无关节炎；1分：关节有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节中度红肿；3分：关节重度红肿；4分：关节严重红肿且不能负重［7］。

1.7病理学观察于最后一次灌胃后1 h处死大鼠，切取右侧踝关节，4%多聚甲醛固定后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，浸蜡、包埋、切片，随后进行苏木精-伊红（HE）染色。光学显微镜观察组织病理变化，并进行病理评分（包括滑膜细胞增殖、细胞侵蚀、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀）［6］，病理评分越高表明关节组织结构的破坏越严重。

1.8血清和关节滑液TNF-α、IL-1β的测定纵行切开大鼠左侧后肢膝关节皮肤，暴露膝关节，打开膝关节腔，用0.9%氯化钠溶液1 mL冲洗关节腔，收集关节滑液［8］。大鼠血清和关节滑液TNF-α、IL-1β水平的测定采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法。

1.9统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。观测资料主要是计量资料，以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1对足爪肿胀度的影响结果见表1。造模后d9，模型组、五痹汤组和甲氨蝶呤组双侧足爪出现明显的肿胀，d18达到峰值，之后各组大鼠足爪肿胀度逐渐降低。建立模型后，甲氨蝶呤组大鼠的足肿胀与模型组相比在d18后有所减轻（P＜0.05）。与模型组相比，五痹汤组大鼠d21开始足肿胀缓解（P＜0.05），与甲氨蝶呤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀度/（mL，±s）

表1佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀度/（mL，±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05

组别模型组五痹汤组甲氨蝶呤组F值P值d23 0.67±0.30 0.41±0.29a 0.36±0.17a 4.094 0.028鼠数10 10 10 d9 0.41±0.26 0.50±0.34 0.45±0.33 0.209 0.813 d12 0.56±0.33 0.58±0.47 0.53±0.29 0.046 0.956 d15 0.62±0.49 0.60±0.32 0.58±0.33 0.027 0.974 d18 0.89±0.38 0.64±0.12 0.50±0.45a 3.241 0.055 d21 0.75±0.20 0.54±0.11a 0.49±0.19a 6.474 0.005

2.2对AI评分的影响造模后d9模型组有不同程度的关节炎表现，随着病程的延长，AI指数逐渐升高，d18达到峰值，随后逐渐降低。与模型组相比，五痹汤组与甲氨蝶呤组大鼠AI评分明显降低，从d18起差异有统计学意义（P＜0.05）。五痹汤组与甲氨蝶呤组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但从均值分析来看，甲氨蝶呤组AI评分更低，表明五痹汤和甲氨蝶呤均有缓解关节炎症的作用，而后期甲氨蝶呤的治疗效果更佳（表2）。

2.3对踝关节病理评分的影响踝关节切片HE染色结果显示，健康组大鼠关节结构完整，滑膜组织无充血与水肿，关节软骨表面光滑。模型组大鼠可见滑膜组织水肿，并可见小血管形成，伴有大量炎症细胞浸润，滑膜细胞增生，血管翳形成，局部滑膜组织造成软骨损伤和骨侵蚀。模型组大鼠踝关节切片病理评分明显增高，与健康组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。五痹汤组与甲氨蝶呤组大鼠踝关节病理评分均低于模型组（P＜0.05）。见表3。

2.4对血清和关节滑液TNF-α、IL-1β水平的影响与健康组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平均升高（P＜0.05）；给药14 d后，五痹汤组和甲氨蝶呤组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显降低，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，甲氨蝶呤组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平下降更为明显。

与健康组相比，模型组、五痹汤组大鼠关节滑液TNF-α、IL-1β的水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，五痹汤组和甲氨蝶呤组大鼠关节滑液TNF-α、IL-1β水平明显降低（P＜0.05）。见表4。

表2佐剂性关节炎大鼠关节炎指数（AI）评分/（分，±s）

表2佐剂性关节炎大鼠关节炎指数（AI）评分/（分，±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05

组别模型组五痹汤组甲氨蝶呤组F值P值d23 8.87±4.02 5.05±2.09a 3.89±1.71a 8.685 0.001鼠数10 10 10 d9 2.70±1.31 2.50±0.99 3.55±1.67 1.700 0.202 d12 7.43±3.50 5.88±3.24 6.70±2.48 0.624 0.543 d15 9.25±2.78 7.80±1.01 7.72±3.07 1.224 0.310 d18 11.12±2.43 8.14±1.38a 6.21±2.90a 11.318 0.000 d21 10.44±3.01 6.56±3.12a 4.11±2.33a 12.617 0.000

表3各组大鼠踝关节病理评分比较/（分，±s）

表3各组大鼠踝关节病理评分比较/（分，±s）

注：与健康组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别健康组模型组五痹汤组甲氨蝶呤组F值P值骨质侵蚀0.40±0.52 1.60±0.97a 0.70±0.67b 0.50±0.71b 5.544 0.003鼠数10 10 10 10滑膜细胞增殖0.10±0.32 2.10±0.88a 1.20±0.92ab 0.50±0.71b 13.813 0.000细胞侵蚀0.20±0.42 1.40±0.84a 0.50±0.71b 0.50±0.71b 3.545 0.024血管翳形成0.40±0.52 2.10±0.74a 1.00±0.82b 0.70±0.82b 10.17 0.000炎症0.70±0.67 2.10±0.74a 1.10±0.88b 1.00±0.82b 6.043 0.002

3 讨论

类风关是一种不断发展的与免疫失调相关的系统性疾病，在病人中不同程度影响关节，随之而来的是许多并发症。流行病学调查资料显示，在中低收入国家男性类风关的患病率为0.16%（95%CI：0.11%～0.20%），女性达到 0.75%（95%CI：0.60%～0.90%）［9］。类风关发作之前的细胞因子存在明显的波动，其中一些细胞因子已与关节炎形成过程中的自身抗体激活以及相关关节的疼痛和骨骼破坏有关，细胞因子可能触发了从全身免疫到关节炎的转变。细胞因子的暴露还可以进一步触发滑膜基质细胞，以维持促炎环境。在某些情况下，细胞因子之间所产生的相互作用可促进浸润的免疫细胞之间的串扰，甚至维持异位淋巴结构的发育，这些最终成为关节炎难以解决的源头。目前，由于尚不清楚其确切的发病机理，在治疗方法以消炎止痛及延缓进展的对症治疗为主，临床上，类风关病情通常难以控制而时常复发［10］。中医治疗类风关源远流长，近年来，一些报道显示中西医结合疗法更能使病人受益，联合西药增效的同时亦可减低西药治疗所引起的毒副作用［11-12］。

表4 各组大鼠血清和关节滑液肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）水平比较/（pg/mL，±s）

表4 各组大鼠血清和关节滑液肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）水平比较/（pg/mL，±s）

注：与健康组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别TNF-αIL-1β健康组模型组五痹汤组甲氨蝶呤组F值P值关节滑液25.12±3.57 43.90±3.21a 32.11±1.82ab 28.03±4.94b 53.680 0.000鼠数 1 0 10 10 10血清40.70±3.33 165.54±21.81a 105.62±7.01ab 78.20±5.67ab 194.679 0.000关节滑液19.63±4.28 38.33±8.67a 22.04±5.30b 17.13±3.43b 27.515 0.000血清9.88±0.62 33.67±4.51a 19.10±3.85ab 15.02±2.56ab 82.996 0.000

五痹汤主治风寒湿痹，经络不利，肢节疼痛，麻痹不仁。方中以姜黄为君，姜黄散风寒，行气血，通经止痛，入血分能活血行瘀，入气分能行散滞气，具有气血兼理之功效［3］；羌活祛风除湿；防己祛风湿止痛；生姜辛散寒湿；白术健脾除湿，甘草调和诸药。全方配伍，共达散风除湿，通络止痛之效。临证之时，如见腰骶痛，加桑寄生、杜仲；肩背痛，加防风、桑枝；腰腿痛，加续断、牛膝、威灵仙等。

大鼠佐剂性关节炎模型是类风关动物模型的雏形，制备方法简单易行，其病理学改变表现与人类类风关相似，因此被广泛应用于研究类风关发病和寻找新的治疗方法［13-14］。在本实验中，造模后d9大鼠开始出现明显的关节红肿，以踝关节为重，并逐渐加重，可侵及足垫甚至全足，观察至d18，AI评分达到最高。本实验中所制备的佐剂性关节炎大鼠模型特征与李培培等［6］的研究中所描述的相符合，模型建立成功。

为进一步探讨五痹汤对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用，于造模后出现炎症反应后即给予药物干预治疗，甲氨蝶呤为阳性对照药。甲氨蝶呤是治疗类风关的主要药物，但是，在肾功能不全或痴呆的情况下，甲氨蝶呤则无法使用，此时生物制剂单一疗法可能是一种治疗选择，而糖皮质激素应尽可能减少，因为它是感染的危险因素之一。本研究发现，与模型组相比，在足爪肿胀度、炎症程度及病理变化上五痹汤组和甲氨蝶呤组均有所改善，提示五痹汤和甲氨蝶呤对大鼠佐剂性关节炎起到一定的治疗效果，并且五痹汤对大鼠佐剂性关节炎的疗效与甲氨蝶呤相当。

类风关病人血清中TNF-α、IL-1β、白细胞介素6（IL-6）等细胞因子与其疾病活动度密切相关，这些细胞因子参与炎症反应在类风关的病理过程中发挥重要作用［15］。这些炎症细胞因子中TNF-α、IL-1β发挥的作用尤为重要［16］。TNF-α可诱导血管细胞黏附因子、血管内皮生长因子和组织因子等的表达，这些分子作用于血管内皮细胞，促进滑膜血管翳的生成。IL-1β与TNF-α两者间还可发挥协同作用，同时刺激软骨细胞以及成纤维样滑膜细胞，产生炎性介质，促进软骨基质降解和关节软骨的破坏［17-18］。在过去的20年中，有效的生物制剂和小分子激酶抑制剂的开发大大提高了临床疗效。抗TNF药物是首个用于治疗类风关的分子靶向药物。但是，抗TNF药物的使用存在许多未解决的问题，包括感染的风险，原发性无反应者，继发性疗效下降和药物经济学问题。因此有必要寻找有效而又安全的新药物［19］。本研究结果显示五痹汤能有效降低佐剂性关节炎大鼠血清和关节滑液TNF-α、IL-1β水平，提示五痹汤具有缓解模型大鼠全身和关节局部炎症细胞因子浸润，从而起到改善关节炎症的作用。

本研究显示，五痹汤可减轻佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀，缓解关节炎症反应，改善踝关节病理评分，降低血清和关节滑液TNF-α、IL-1β水平，对大鼠佐剂性关节炎具有治疗作用。