脂质代谢相关通路蛋白基因多态性的分布特征及与aMCI关系研究

王金侠 陈民

遗忘型轻度认知功能障碍（amnestic mild cognitive impairment，aMCI）是介于正常老化与轻度痴呆之间的一种中间过渡状态，是AD 的早期阶段，其患病率因诊断标准不同而差异性较大，约为5%～20%。每年约有15%的aMCI 人群会转化成痴呆，被认为是痴呆的“预警信号”，他为痴呆的防治提供了一个“机会之窗”［1-2］。目前全基因组关联研究已发现多个染色体区域很可能存在与AD 有关的基因突变，但只有载脂蛋白E（ApoE）等位基因在世界范围内得到了公认。由于ApoE 是中枢神经系统最重要的载脂蛋白，在胆固醇动员、重新分布及排泄等代谢过程中均具有重要作用，因此人们推测血脂代谢紊乱可能参与AD 发病过程。我们的前期研究发现，高脂饮食可以加剧巴马小型猪海马、大脑皮层中的β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积及增加血清中Aβ 的含量［3-6］。因此，寻找更多的脂代谢相关候选基因，对将来AD 的基因诊断和靶点治疗至关重要。相关研究显示，ApoE、低密度脂蛋白受体（LDLR）、ATP 结合盒转运蛋白A7（ABCA7）基因多态性与aMCI 可能存在相关性，但关联研究尚处于不确定阶段。本研究以aMCI 为研究对象，探讨aMCI 脂质代谢相关通路蛋白基因多态性的分布特征及与aMCI 的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 遵循病例对照试验原则，本研究在2016 年12 月至2018 年3 月间分别从沈阳市2 个三级甲等综合性医院（辽宁中医药大学附属医院、沈阳军区总医院）及6个沈阳市养老中心（沈阳市皇姑区塔湾新家园敬老院、沈阳市养老院、沈阳市于洪区中心敬老院、沈阳市苏家屯区社会福利院、沈阳市合众优年养老社区、沈阳市大东区爱达养老公寓）选取600例有效样本。其中aMCI病人300例，年龄60～101岁，平均（75.90±11.21）岁，男192 例，女108 例；与之年龄、性别、疾病史相匹配的认知功能正常的老年样本300例，年龄62～100 岁，平均（73.71±11.87）岁，男189 例，女111 例。所有入选对象均为沈阳地区常住人口，且均为汉族。本研究由辽宁中医药大学附属医院伦理委员会通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入标准和排除标准

1.2.1 aMCI组纳入标准：（1）参照美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版（DSM-Ⅳ）的MCI诊断标准［7］，符合aMCI 的诊断标准；（2）年龄≥60 岁；（3）MMSE 评分标准为：文盲16～18 分，小学19～21分，初中22～24分，高中及以上25～27分；HIS 缺血指数量表（Hachinski，HIS）≤4 分；汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD）≤12 分（17 项量表）；临床痴呆评估（CDR）0或0.5分；Barthel生活活动量表（ADL）≥80 分；（4）无严重的心、肺、肝、肾功能障碍；（5）无慢性病急性加重或发作状态；（6）无急性感染性疾病；（7）视力及听力无明显障碍，能够顺利完成问卷。

1.2.2 认知正常组纳入标准：（1）MMSE 评分标准为：文盲＞18 分，小学＞21 分，初中＞24 分，高中及以上＞27 分；HIS 评分≤4 分；HAMD 评分（17 项量表）≤12分；CDR 为0 分；ADL 评分≥80 分。（2）日常生活功能良好。

1.2.3 排除标准：（1）既往有卒中史；（2）血管性痴呆或其他原因导致的痴呆；（3）引起脑功能障碍的其他神经系统疾病（如PD、正常脑压脑积水或脑炎等）；（4）认知损害由颅外伤所致；（5）其他可引起认知功能损害的疾病，如严重贫血、梅毒、甲状腺功能异常、艾滋病等；（6）心、肺、肝、肾等功能衰竭，急性感染或重度感染性疾病；（7）中毒性脑病病人。

1.3 方法

1.3.1 临床资料采集：收集年龄、性别、受教育程度、疾病史、饮酒史、吸烟史、体育锻炼、生活方式等资料。

1.3.2 基因分型方法：本项目委托上海天昊生物技术有限公司进行，采用iMLDRTM多重单核苷酸多态性（SNP）分型试剂盒对600 个样本进行5 个SNPs 位点分型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布的数据组间比较采用t 检验，非正态分布数据组间比较采用Maim-Whitney U 检验;计数资料用频次表示，组间比较采用卡方检验。探讨因变量与多个自变量的关系采用多元回归分析。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组的基本资料比较 aMCI 组的受教育程度、MMSE 评分、ADL 评分皆低于认知正常组，HAMD 评分高于认知正常组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。aMCI组的吸烟史、饮酒史病人比例较认知正常组高（P ＜0.05）。见表1。

表1 2组的一般资料比较（n，n=300）

续表1

2.2 标签基因多态性哈温伯格（Hardy-Weinberg）平衡分析 研究中4 个基因共5 个标签SNPs，通过Hardy-Weinberg 平衡定律检验发现，所有SNPs 均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P ＞0.05）。

2.3 2 组ApoE ε2、ε3、ε4 基因多态性分布 2 组间ApoE ε2/2、ε4/4 基因型和ε2、ε4 等位基因频率差异有统计学意义（P ＜0.01）。见表2。

表2 2组ApoE ε2、ε3、ε4的基因型和等位基因型频率分布（n，%，n=300）

2.4 2 组LDLR 基因rs688 和rs5925 多态性分布 2组rs688 基因型分布差异具有统计学意义（P ＜0.05）；aMCI 组C 等位基因频率高于认知正常组（88.50%比84.00%，P ＜0.05）。而2 组LDLR rs5925 基因多态性比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

2.5 2 组ABCA7 基因rs3752246 多态性分布 2 组间ABCA7 rs3752246 基因多态性比较，差异有统计学意义（P ＜0.01）。见表4。

表3 2组LDLR基因rs688和rs5925多态性分布（n，%，n=300）

表4 2组ABCA7 rs3752246基因多态性分布（n，%，n=300）

2.6 各基因多态性与aMCI 相关性的多因素Logistic回归分析 经校正性别、受教育程度、吸烟史、饮酒史、生活方式、体育锻炼、疾病史等因素后，结果显示，ApoE ε4等位基因是aMCI的易感等位基因，aMCI发病率是非ε4 携带者的1.453 倍；ε2 等位基因是aMCI 的保护等位基因，aMCI 发病率是非ε2 携带者的0.498倍。ABCA7 的rs3752246 基因多态性与aMCI 发病存在明显相关性，C 等位基因携带者是非携带者发病率的2.092 倍。LDLR 的rs688 基因多态性与aMCI 发病存在明显相关性，T 等位基因携带者是非携带者发病率的1.356倍。见表5。

3 讨论

ApoE 是一种载脂蛋白，其基因位于19 号染色体上，在人群中呈多态性。其遗传多态性主要受控于两个SNP 位点rs429358 和rs7412，并通过不同的核酸组合决定了ApoE 的3 种等位基因型：ε2、ε3、ε4［8］。ApoE ε4 等位基因是迟发型AD 的主要遗传风险因素，携带ε4 等位基因者发展为AD 的风险增加2～3 倍［9］。与非ε4 个体相比，ε4 携带者早在40 岁时即表现出脑淀粉样蛋白病理改变并且经历更快的认知下降［10］。另外，ApoE ε4 还可促使脑内tau 蛋白发生异常磷酸化，形成神经纤维缠结（NFT）。有研究将鼠ApoE 基因敲除后，发现神经元突触完整性和可塑性受到影响；将老龄鼠ApoE 基因敲除后，其表现出类似AD 的一些特征：胆碱能神经元丢失、过多脂质氧化、认知紊乱、突触丢失、异常tau 蛋白磷酸化等。在本研究中也发现，ApoE 基因多态性确实与aMCI 发病相关，ApoE ε4是aMCI 发病的危险因素，而ApoE ε2 则是保护性因素。

表5 各基因多态性与aMCI相关性的多因素Logistic回归分析

LDLR 基因位于人类第19 号染色体短臂末端（p13.1-p13.3），全长45 kb，由18 个外显子和17 个内含子构成。rs5925位点位于LDLR 第18个外显子NocI限制性酶切多态位点，rs5925位点基因多态性与TC 和LDL 水平间有明显的剂量效应关系，LDLR 基因rs688位点位于LDLR 基因的第12 个外显子中［11］。LDLR 在AD 发病机制中的作用，特别是在晚发性AD 中，在过去25 年里被遗传、神经病理学和生物标志物分析（临床研究）或细胞和动物模型系统（临床前研究）研究最多。虽然有一些矛盾的报道，但越来越多的证据表明，LDLR不仅能调节大脑和外周的Aβ，还能维护大脑内稳态，延缓AD 的发病。虽然LDLR rs688 基因多态性对认知障碍的机制并不是很明确，但是有几条证据表明LDLR 基因多态性是与AD 有关的优良候选基因。首先，LDLR 是ApoE 的主要脑受体，其等位基因已被广泛接受用于调节AD 风险［12-13］。其次，LDLR 缺乏与Tg2576 APP 转基因小鼠中Aβ 沉积增加有关，尽管不是PD APP 转基因小鼠，但暗示LDLR 和AD 标记之间可能存在联系。第三，小鼠LDLR 缺乏与学习能力不足有关。最后，rs688 基因多态性都与胆固醇稳态有关，胆固醇稳态本身与Aβ 的产生和AD 风险有关［14］。在本研究中也发现，rs688 确实与aMCI 发病相关，rs688 T等位基因是aMCI发病的易感等位基因。

ABCA7 基因位于染色体19p13.3。ABCA7 可促进胆固醇外流和抑制Aβ分泌，并能通过C1q补体途径增强巨噬凋亡细胞的功能。ABCA7 是大脑小胶质细胞和神经元表达的转运蛋白大家族的一部分。研究结果证明，ABCA7 通过增强吞噬Aβ、凋亡细胞和合成底物的作用来降低AD 的危险性［15］；也有研究显示，ABCA7通过清除Aβ沉积来降低AD的危险性［16-18］。本研究结果表明，ABCA7 rs3752246 C 等位基因是aMCI发病的易感等位基因。

ApoE、LDLR、ABCA7 基因多态性与aMCI 的发病确实存在相关性，但其在认知障碍发病机制中的作用还有待进一步阐明。