FAM83A对肺癌诊断的临床意义及其对肺癌细胞增殖和迁移的影响*

黄 雯,仰丽丽,吴付兵

(1.南京医科大学第四附属医院肿瘤科，江苏南京 210000；2.南京市第二医院肿瘤科，江苏南京 210000；3.南京医科大学附属逸夫医院肿瘤科，江苏南京 210000)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均逐年上升，每年至少有160万的新增病例被确诊为肺癌，严重威胁着人类的健康[1-2]。近年来，虽然大多数癌症的生存率稳步上升，但肺癌的生存率进展缓慢，由于其发病过程隐匿，多数患者在确诊时已经发生局部浸润或转移，而发生远处转移的患者5年生存率仅为5.0%[3-5]。因此，了解肺癌发生发展机制，探索新的诊断或治疗靶点成为肺癌领域研究的热门课题。序列相似性为83的家族A成员(FAM83A)，又称为BJ-TSA-9，位于染色体8q24上[6]。最近一些研究发现，FAM83A在肺癌[7-8]、乳腺癌[9]和胰腺癌[10]中异常高表达，很有可能成为这些肿瘤诊断或治疗的潜在生物标志物。但FAM83A在肺癌中的临床意义，以及在肺癌细胞中的生物学作用仍不清楚。本研究旨在探讨肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表达水平及临床意义，进一步分析干扰FAM83A表达对肺癌细胞增殖、转移和侵袭能力的影响，为肺癌的诊断提供新的标志物，也为肺癌的靶向治疗提供潜在的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年8月至2019年8月在南京医科大学附属逸夫医院医院确诊为原发性肺癌的患者102例为研究对象，其中男58例，女44例，在入组前患者均未接受放疗、化疗等治疗。患者的诊断和临床病理特征包括肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移均经过两位以上病理学医生确认。选取同期在医院进行体检的健康人员98例作为对照组，其中男45例，女53例。所有入组人员均签署知情同意书。所有参与者抽取静脉血5 mL用于分离血清检测FAM83A。

1.2仪器与试剂 MTT检测试剂盒购自上海碧云天公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和定量PCR试剂盒购自Takara公司；Transwell小室和Matrigel胶购自美国BD公司；FAM83A和GAPDH单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；ABI PRISM 7500定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1生物信息学分析FAM83A在肺癌组织中的表达 利用生物信息学在线工具“GEPIA” (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FAM83A在肺癌组织和正常组织中的表达。

1.3.2细胞培养与转染 培养肺癌细胞A549和SK-MES-1，取对数生长期的细胞按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染si-FAM83A。在转染中设置siRNA-NC(si-NC)对照组，si-FAM83A-1组，si-FAM83A-2组，荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)确定转染效率。siRNA序列如下，si-FAM83A-1:5′-GCA CAA CAA CAT CAG AGA CCT-3′；si-FAM83A-2:5′-GAC TGG AGA TTT GTC CTG TCT-3′；si-NC:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′。

1.3.3qRT-PCR检测FAM83A mRNA的表达 Trizol试剂提取各组细胞标本中的总RNA。将RNA逆转录成cDNA并进行qRT-PCR检测。扩增引物序列如下：FAM83A上游引物为5′-CCC ATC TCA GTC ACT GGC ATT-3′，下游引物为5′-CCG CCA ACA TCT CCT TGT TC-3′；GAPDH上游引物为5′-AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG-3′，下游引物为5′-AAG GTG AAG GTC GGA GTC AA-3′。以GAPDH作为内参，结果以2-ΔΔCt法进行相对定量表示。实验重复3次。

1.3.4Western blot检测FAM83A蛋白的表达 提取各组细胞中的总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，然后对蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳、转模、封闭，随后加入一抗(FAM83A按1∶1 000稀释，或GAPDH按1∶3 000稀释)4 ℃反应过夜。TBST漂洗膜3次后加入HRP标记二抗，室温条件下反应2 h。然后TBST漂洗膜3次，最后用ECL化学发光试剂盒进行蛋白显影，化学发光成像系统成像检测蛋白质印迹条带。

1.3.5MTT法检测细胞增殖 将转染si-FAM83A或si-NC的肺癌细胞A549和SK-MES-1细胞接种至96孔板中，随后按MTT检测试剂盒说明书检测培养0、24、48、72 h后细胞在570 nm波长下的吸光度，绘制细胞增殖曲线。

1.3.6Transwell实验检测肺癌细胞转移侵袭 转移实验：将Transwell小室放置于24孔板内，将转染si-FAM83A或si-NC的肺癌细胞A549或SK-MES-1细胞接种于上室。培养48 h后用4.0%多聚甲醛溶液对小室膜下面的细胞进行固定，然后用0.1%结晶紫染色。各组随机选取6个视野显微镜下观察拍照并计数。侵袭实验：取100 μL Matrigel胶包被Transwell小室底部膜的上室，其余同转移实验。

2 结 果

2.1生物信息学分析FAM83A在肺癌组织中的表达 生物信息学“GEPIA”分析结果显示，与正常组织相比，肺癌组织中的FAM83A相对表达水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与肺癌组织比较，*P<0.05。

图1 “GEPIA”分析FAM83A在肺癌组织和正常肺组织中的相对表达水平

2.2肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表达 qRT-PCR结果显示，肺癌患者血清中FAM83A mRNA相对表达水平明显高于体检健康者，差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

2.3血清中FAM83A mRNA表达水平在肺癌患者中的诊断作用 以血清中FAM83A mRNA表达水平参数模型作为检验指标，绘制诊断肺癌的ROC曲线。FAM83A mRNA表达水平的ROC曲线下的面积分别为0.927(95.0%CI：0.892～0.962)。其中FAM83A mRNA表达水平诊断肺癌的截断值为2.12时，灵敏度为82.0%，特异度为90.0%。见图3。

2.4肺癌患者血清中FAM83A mRNA表达水平与化学、临床病理特征之间的关系 肺癌患者血清中FAM83A mRNA表达水平与年龄之间无明显相关性，但与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移呈显著相关(P<0.001)。见图4。

注：与肺癌患者比较，**P<0.01。

图2 qRT-PCR检测肺癌患者和体检健康者血清中FAM83A mRNA表达水平

图3 血清中FAM83A mRNA表达水平诊断肺癌的ROC曲线

图4 患者血清中FAM83A mRNA表达水平与临床病理特征之间的关系

2.5转染si-FAM83A对肺癌细胞FAM83A mRNA和蛋白表达的影响 将si-FAM83A或si-NC转染A549和SK-MES-1细胞24 h后，qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，si-FAM83A组的A549和SK-MES-1细胞中FAM83A mRNA相对表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1细胞中干扰FAM83A mRNA表达效率高于si-FAM83A-2。Western blot结果显示与si-NC组相比，si-FAM83A组的A549和SK-MES-1细胞中FAM83A蛋白相对表达水平显著降低，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1细胞中干扰FAM83A蛋白表达效率高于si-FAM83A-2。因此，选用si-FAM83A-1(si-FAM83A)转染细胞进行下一步实验。

注：A和B分别表示Transwell转移实验检测干扰FAM83A表达对A549和SK-MES-1细胞转移能力的影响。***P<0.001。

图5 干扰FAM83A表达抑制肺癌细胞转移

注：A和B分别表示Transwell侵袭实验检测干扰FAM83A表达对A549和SK-MES-1细胞侵袭的影响。***P<0.001。

图6 干扰FAM83A表达抑制肺癌细胞侵袭

2.6干扰FAM83A表达对肺癌细胞增殖的影响 MTT实验结果表明，细胞培养24、48、72 h这3个时间点时，与si-NC组相比，转染si-FAM83A组细胞的吸光度值随时间延长而逐渐下降，且幅度逐渐增大，其中培养72 h后表现最显著。在培养72 h后的A549细胞中，与si-NC组细胞的吸光度值(1.307±0.030)相比，si-FAM83A组细胞的吸光度值(0.939±0.030)明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，在培养72 h后的SK-MES-1细胞中，与si-NC组细胞的吸光度值(1.527±0.032)相比，si-FAM83A组细胞的吸光度值(1.234±0.030)明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.7干扰FAM83A表达对肺癌细胞转移能力的影响 Transwell转移实验结果表明，在A549细胞中，与si-NC组视野平均转移细胞数(112.000±9.160)相比，si-FAM83A组视野平均转移细胞数(34.000±3.300)显著减少，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图5。在SK-MES-1细胞中，与si-NC组视野平均转移细胞数(138.000±10.410)相比，si-FAM83A组视野平均转移细胞数(68.500±4.300)显著减少，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2.8干扰FAM83A表达对肺癌细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果表明，在A549细胞中，与si-NC组视野平均侵袭细胞数(75.300±4.500)相比，si-FAM83A组视野平均侵袭细胞数(36.830±2.710)显著减少，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图6A。在SK-MES-1细胞中，与si-NC组视野平均侵袭细胞数(115.180±9.500)相比，si-FAM83A组视野平均侵袭细胞数(58.560±4.310)显著减少，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图6B。

3 讨 论

肺癌，连同肝癌和结直肠癌是全世界癌症死亡的三大主要原因，近年来其发病率呈上升和年轻化趋势，肺癌的发生、发展和转移是一个复杂的多基因参与的调控过程[11-13]。因此，研究肺癌增殖、转移的分子机制对肺癌的诊断和治疗具有重要的临床意义。

在乳腺癌中FAM83A的表达明显升高，与乳腺癌的预后显著相关[14]。在胰腺癌中FAM83A显著过表达，并与胰腺癌患者的癌症干细胞数目及整体生存率呈显著相关性[10]。还有研究表明FAM83A在肺腺癌和非小细胞肺癌组织中高表达，且和预后明显相关[7,15]。以上研究表明FAM83A在肿瘤中高表达，且与患者的预后不良密切相关。本研究通过“GEPIA”分析发现FAM83A在肺癌组织中显著高表达，进一步在肺癌患者血清中发现FAM83A mRNA显著高表达，且与患者肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移呈明显相关性，提示血清FAM83A的高表达与肺癌发展密切相关，提示血清FAM83A可能和肺癌患者的预后不良也相关，该结果和以往的研究结果类似[7,15]。以血清中FAM83A mRNA表达水平进行肺癌诊断时ROC曲线下面积为0.927，最佳截断值为2.120，具有较高的灵敏度和特异度。以上研究结果表明血清中FAM83A表达能够作为肺癌的诊断标志物，并和肺癌的发生发展密切相关。

现有研究虽然都有报道FAM83A的表达，但FAM83A在肺癌中具体发挥着什么作用仍有许多未知。干扰FAM83A能够显著抑制HER2+乳腺癌细胞的增殖，促进其凋亡[16]。还有研究表明在体外和体内干扰FAM83A能显著降低乳腺癌细胞的增殖和转移能力[9]。本研究发现干扰FAM83A表达可对A549和SK-MES-1细胞增殖、转移和侵袭产生明显的抑制作用，表明干扰FAM83A能够抑制肺癌的发生发展。SHI等[17]报道发现LncRNA FAM83A-As能显著提高FAM38A蛋白水平，诱导ERK磷酸化，从而促进肺癌细胞增殖和侵袭。本研究结果与SHI等[17]发现相似，表明FAM83A在肺癌中发挥癌基因的作用，提示FAM83A可能成为肺癌治疗的潜在靶点。本研究证实FAM83A对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭起着至关重要的作用，但至于FAM83A影响肿瘤细胞转移特性的具体作用机制尚不清楚，有待进一步研究。后续将继续在动物体内探讨FAM83A对肿瘤增殖和转移能力的影响。

4 结 论

血清中FAM83A mRNA能够作为肺癌的诊断标志物，同时，干扰FAM83A表达能够抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，可为肺癌的预防和治疗提供潜在的靶点。