金黄色葡萄球菌耐药性分布特征及分子流行病学研究

丛萌倩

(青海大学附属医院检验科，青海西宁 810001)

金黄色葡萄球菌(SA)是环境中广泛分布的一种革兰阳性菌，通常定植于鼻黏膜、皮肤组织等皮肤表面，从而引起包括皮肤和软组织在内的局部化脓性感染，严重时也可引起心内膜炎、脑膜炎、败血症、脓毒症等全身感染，是导致院内感染的重要致病菌[1]。伴随着抗菌药物的广泛使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)迅速扩散到世界各地。早期发现的MRSA菌株由于来源于住院患者，一般被称为医院获得性MRSA(HA-MRSA)，其耐药性是由于SA携带了可水平移动的耐药元件葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)，随着SCCmec的传播，又出现了社区获得性MRSA(CA-MRSA)[2]。根据中国细菌耐药监测网(CHINET)的监测数据显示，2017年我国综合性医院检出的MRSA在所有SA中的占比约为35.30%，且对青霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星等临床常见抗菌药的耐药性均在50.00%以上[3]。由于MRSA对多种抗菌药物存在耐药性，并且存在耐药性从医院向社区扩散的风险，控制MRSA医院内感染的形势十分严峻。本研究对2015年1月至2017年12月本院临床科室送检样本进行SA的检测，并对其进行MRSA的判定及耐药性分析，同时通过聚合酶链式反应(PCR)方法检测杀白细胞素(pvl)基因携带情况，以明确本院SA菌株中MRSA的流行情况和耐药情况，从而为临床合理使用抗菌药物并有效控制MRSA传播提供科学依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源

1.1.1临床分离株 按照原卫生部颁发的《医院感染诊断标准(试行)》[4]，收集本院2015年1月至2017年12月所有临床送检样本(包括住院患者和门诊患者)中分离并进行鉴定的SA菌株，剔除重复菌株，同一患者只选取一株分离株进行分析。

1.1.2标准菌株 ATCC25923为SA标准株，ATCC43300为MRSA标准株，购自上海北诺生物科技有限公司，本实验室保存。

1.2研究方法

1.2.1菌株鉴定 SA的鉴定根据《全国临床检验操作规程》(第4版)的流程进行[5]；MRSA的鉴定采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)2016版推荐的纸片扩散法(K-B法),筛选30 μg头孢西丁药片抑菌环直径≤21 mm的菌株[6]，然后通过PCR扩增mecA基因，K-B法耐药和mecA基因阳性的菌株判定为MRSA。

1.2.2药敏试验 根据CLSI 2016的K-B法[6]，检测SA菌株对临床常见10种抗菌药物的药物敏感性，检测的抗菌药物包括：青霉素、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、庆大霉素、利福平、头孢唑啉、复方磺胺甲噁唑、万古霉素。

1.2.3DNA提取及基因检测 总DNA提取采用煮沸法，挑取血平板上生长良好的SA单克隆，接种到200 μL TE缓冲液(pH 8.0，含15 U/mL溶葡球菌酶)配制为菌悬液，35 ℃水浴30 min后，沸水浴10 min，12 000 g离心5 min，收集含有细菌DNA的上清液，-20 ℃冻存备用；采用PCR检测菌株携带pvl基因情况。PCR反应体系及引物参见徐银海等[7]文献报道。

1.3统计学处理 所有数据采用SPSS16.0软件和Microsoft Office Excel2000进行分析处理。分类资料采用构成比表示，分类资料组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1SA菌株分布情况 2015年1月至2017年12月本院实验室共收集SA临床分离株441株，其中406株来源于住院患者，35株来源于门诊患者。通过K-B法结合mecA基因扩增，结果见图1。共检出MRSA 147株，总检出率为33.33%，其中住院患者样本检出145株，占住院患者样本的35.71%，门诊患者样本检出2株，占门诊样本的5.71%，住院患者的MRSA检出率显著高于门诊患者的检出率，差异有统计学意义(χ2=13.05，P<0.001)。MRSA检出情况按年分布结果见图2，各组别各年份MRSA的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。2015年MRSA总检出率为36.69%，其中住院患者样本MRSA检出率为39.84%，门诊患者为0；2016年MRSA总检出率为32.89%，住院患者样本MRSA检出率为35.25%，门诊患者样本MRSA检出率为7.69%；2017年MRSA总检出率为30.67%，住院患者样本MRSA检出率为32.37%，门诊患者样本MRSA检出率为9.09%。

注：M为DNA标志物；N为阴性对照；P为阳性对照(310 bp)；1～4为检测样本，其中2为mecA阴性，其余为阳性。

图1 mecA基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 2015-2017年MRSA菌株的检出率

2.2SA菌株对抗菌药的敏感率 对SA菌株进行常见10种抗菌药物的敏感试验，结果见表1。除万古霉素以外，住院患者来源的SA菌株耐药率普遍高于门诊患者来源的SA菌株。无论是住院患者还是门诊患者，分离到的SA菌株对青霉素都呈现普遍耐药，耐药率分别为100.00%和88.57%。住院患者来源的SA菌株对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、庆大霉素、头孢唑啉的耐药率均大于50.00%，而门诊患者来源的SA菌株对以上药物的耐药率均未超过50.00%。所有SA菌株对利福平和复方磺胺甲噁唑的耐药率均比较低，总体耐药率分别为7.26%和12.02%，未发现对万古霉素有耐药性的SA菌株。

表1 不同样本来源SA菌株对常见抗菌药的耐药率[n(%)]

2.3SA菌株的毒力基因pvl携带情况及与耐药的关系 应用PCR扩增pvl基因，共检出28株SA携带pvl基因，总体携带率为6.35%(结果见图3和表2)，其中21株来自于住院患者样本(5.17%)，另外7株来自于门诊患者样本(20.00%)，门诊患者来源的样本pvl基因携带率明显高于住院患者，差异有统计学意义(χ2=11.91，P=0.001)。

注：M为DNA标志物；N为阴性对照；P为阳性对照(430 bp)；1～5为检测样本，其中2和3为pvl阳性，其余为阴性。

图3 pvl基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

表2 不同样本来源SA菌株的pvl基因携带情况

注：a住院患者数据和门诊患者数据进行比较。

SA菌株按照是否携带pvl基因，进一步分层分析其与抗菌药耐药的关系，结果见表3。pvl携带情况仅与复方磺胺甲噁唑的耐药性相关，pvl“-”菌株的耐药性略高(χ2=4.08，P=0.043)，pvl是否阳性与其他检测抗菌药药物的耐药性没有显著关联。

表3 pvl基因携带与常见抗菌药耐药的关系[n(%)]

注：-表示未进行统计分析。

3 讨 论

以MRSA为代表的耐药SA感染，在使用抗菌药物治疗时极易取代敏感株变成流行株从而导致治疗失败，已经成为临床治疗需要重视的问题。本研究对临床样本中SA菌株进行耐药性检验，可以了解MRSA等耐药菌株的流行趋势，同时,为临床的合理用药、提高治疗效率提供依据。

徐小玲等[8]对2012年1月至2012年12月国内医院MRSA感染率文献进行荟萃分析，发现MRSA感染率为33.50%～92.61%。最近5年CHINET的监测数据显示，MRSA的检出率出现了持续下降，2017年34所医院MRSA的检出率在10.30%～62.10%[3,9-10]。本院MRSA检出率从2014年的36.69%下降到30.67%，处于中间水平，虽然各年份之间差异无统计学意义，但是总体趋势出现了下降，提示最近几年医院的MRSA防控工作有一定效果。本研究还发现MRSA检出率与样本来源有关，住院患者样本的MRSA检出率显著高于门诊患者样本的MRSA检出率，这应该与住院患者往往需长期使用抗菌药物,且治疗期间有侵入性操作相关，同时,住院时间较长和辗转科室较多也是MRSA检出率高的危险因素[11]。

本研究发现，住院患者样本的SA菌株耐药率普遍高于门诊患者样本，这与国内外文献报道一致[12-14]。住院患者样本的SA耐药株呈现出对青霉素的普遍耐药，住院患者的SA菌株对阿莫西林和头孢唑啉的耐药率也高于50.00%，提示在临床治疗时对于住院患者出现SA感染，选择β-内酰胺类药物的效果可能会很差，但是对于门诊患者，还是可以选择青霉素类之外的其他β-内酰胺类药物。研究中的SA菌株，对于红霉素和克林霉素的耐药率也比较高，所以临床治疗也应尽量不选择大环内酯类和林可酰胺类药物。对于门诊患者，其他抗菌药的耐药率均比较低，所以临床治疗的选择比较多，但是住院患者的SA菌株还对左氧氟沙星和庆大霉素有较高的耐药率，只对利福平、复方磺胺甲噁唑、万古霉素普遍敏感。所以，对于住院患者SA感染的治疗可选择的药物种类明显减少。万古霉素等糖肽类抗菌药物是目前应对细菌感染的最后一道防线，虽然本研究未检出对万古霉素耐药的SA菌株，但是研究发现MRSA比一般敏感菌株对万古霉素的敏感性降低[15]，因此，临床上更需重视菌株耐药性的监测。

pvl是SA菌株分泌的一种溶细胞毒素，可以作用于巨噬细胞和单核细胞，造成大量白细胞的损伤，从而导致死亡等严重的感染结局，是SA菌株毒力的重要来源[16]。目前研究表明，pvl基因与CA-MRSA感染存在相关性，通常认为携带pvl基因是CA-MRSA的重要特征[17]。本研究pvl携带率为6.35%，比叶千红等[18]和杨颖等[19]报道的检出率要低，而与曾云祥等[20]报道的检出率接近，比国内研究报道的检出率要高[7,13,21]，这可能与地区差异有关。门诊患者来源的SA菌株其pvl基因分离率显著高于住院患者样本的分离率，说明pvl基因主要来源为社区获得，与目前已有[18]的报道一致。pvl+与pvl-的SA菌株对除复方磺胺甲噁唑以外的常见抗菌药耐药率没有显著差异，这与杨颖等的报道一致[19]。pvl-的SA菌株对复方磺胺甲噁唑的耐药性略高，但是考虑到SA菌株对复方磺胺甲噁唑普遍敏感，且对复方磺胺甲噁唑耐药的菌株总体数量较少，所以，临床治疗使用复方磺胺甲噁唑依然能取得较高的治疗效果。值得注意的是，pvl携带情况虽然与抗菌药耐药没有明显关联，但是因为pvl毒素与坏死性肺炎存在显著相关，近年来关于pvl+的SA菌株感染导致死亡病例逐渐增加，因此，临床还是需要重视对此类SA菌株的治疗[22-23]。

4 讨 论

本院临床分离的SA菌株中MRSA检出率在2015-2017年未见明显变化，且pvl基因携带率较低，但对多种常见抗菌药物有较高耐药率，住院患者样本的MRSA检出率和耐药率均高于门诊患者，今后需要注意临床合理用药并加强对SA感染的监测，有效控制耐药株的产生和流行。