柱前衍生化-HPCE法测定霍山石斛中游离氨基酸

陈乃东， 朱 赛， 王荣花， 徐文冬， 石敏珠

(1. 皖西学院 生物与制药工程学院， 六安 237012; 2. 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室院， 六安 237012)

游离氨基酸作为中药炮制或食品加工过程中参与米拉德反应的底物，是影响中药炮制中组分变化和食品风味的关键物质[1-2]。霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，是兰科石斛属的草本植物[3-5]，含多糖、多酚、皂苷、生物碱等成分[6-10]，具有抗氧化、增强免疫、明目、预防治疗心血管疾病、延缓衰老等功效[11-12]。由于霍山石斛鲜品难以保存，传统用药方式以其加热炮制成干燥品的茎入药，开展霍山石斛游离氨基酸研究对于揭示霍山石斛炮制机制、霍山石斛资源综合利用具有重要意义。

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)具有仪器简单、样品用量少、应用范围广、分离效率高、污染小、成本低等优点，已在中药的指标成分含量分析研究中应用广泛[13-17]。在本课题组的前期研究中，采用柱前衍生化HPLC对霍山石斛总游离氨基酸进行分析[18]，本文构建一种异硫氰酸苯脂柱前衍生化-HPCE分离和测定多种游离氨基酸方法，对霍山石斛中游离氨基酸进行定性定量分析，为深入研究霍山石斛在炮制过程中所发生的化学变化、揭示其炮制机制及其资源开发利用提供候选方法。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料2018年4月采自皖西学院植物园，品种经皖西学院陈乃东教授鉴定为霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，洗净，取其根，茎，叶，-50 ℃冷冻干燥至恒重，粉碎以备用。

十水合四硼酸钠，磷酸氢二钾，氢氧化钠(纯度≥99.7%，均购自西陇化工股份有限公司)，盐酸(含量36%～38%，中国宿州化学试剂有限公司)，正己烷(纯度≥95%，美国Tedia有限公司)，三乙胺(纯度≥98%，阿拉丁公司)，乙腈(纯度≥99.9%，阿拉丁公司)，甲醇(纯度≥99.9%，阿拉丁公司)，异硫氰酸苯酯(PITC)(纯度≥99.9%，Sigma-Aldrich公司)。氨基酸标准品:D-脯氨酸(Pro)、L-组氨酸(His)、DL-异亮氨酸(Ile)、L-精氨酸(Arg)、DL-苯丙氨酸(Phe)、DL-色氨酸 (Trp)、D-丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、L-苏氨酸(Thr)、β-丙氨酸(Ala)、D-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)均购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥98%。

K1060型高效毛细管电泳仪(凯奥科技发展有限公司，北京)，熔融石英毛细管(永年瑞沣光导纤维厂，50 μm，河北)，SZ-97双重蒸馏水器(上海精密仪器仪表有限公司，上海)，FA1204B电子天平(越平科学仪器有限公司，上海)，KQ-300DE型数控超声波清洗器(超声仪器有限公司，浙江昆山)，VORTEX-5 涡旋振荡器( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，BenchTop Pro台式冻干机(美国VirTis)，RV10型旋转蒸发仪(德国IKA公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准品的衍生化

精密称取12种氨基酸对照品Trp 2.78 mg，Arg 4.90 mg，Ala 2.21 mg，Ile 2.53 mg，Lys 1.61 mg，Leu 2.61 mg，Phe 3.23 mg，His 3.64 mg，Ser 2.53 mg，Gly 1.79 mg，Pro 3.00 mg，Thr 4.21 mg，置于容量瓶(25.0 mL)中，加0.1 mol/L盐酸定容至容量瓶刻度。精密量取1.0 mL样液于具塞试管(10.0 mL)中，加入14%三乙胺(溶于乙腈)，1.2%异硫氰酸苯酯(溶于乙腈)各0.5 mL混匀，室温避光放置30 min，加入2.0 mL正己烷，用涡旋仪振荡助溶，静置10 min，5000 r/min离心10 min，取下层溶液，制得衍生化溶液，并逐级稀释，配制成不同浓度的衍生化溶液。

1.2.2 分离方法的优化

在预实验的基础上，采用检测波长为254 nm、硼砂-磷酸氢二钾缓冲液，从缓冲液离子浓度、缓冲液pH值、分离电压和毛细管有效长度4个方面对HPCE法分离游离氨基酸的条件进行优化，确定最佳分离条件。

1.2.3 游离氨基酸定量分析

1)氨基酸标准曲线方程的测定

按1.2.2构建的分离方法，检测1.2.1配制的不同浓度的标准品，以峰面积为因变量、浓度为应变量，获得各氨基酸标准曲线。

2)供试品中游离氨基酸含量测定

将霍山石斛根、茎、叶样品，以60%甲醇为提取剂、60 ℃超声辅助提取，固液比=1∶40(g/mL)、超声提取30 min、超声功率240 W、提取4次,合并滤液，按1.2.1所述方法衍生化、采用1.2.2构建的柱前衍生化-HPCE方法与1.2.3中1)构建的标准曲线测定霍山石斛根、茎、叶中游离氨基酸种类及其含量。

2 结果与分析

2.1 总游离氨基酸毛细管电色谱分离条件的确定

2.1.1 缓冲液离子浓度

缓冲液的离子浓度很大程度上影响了最终分离的效果，实验考察了缓冲液浓度对氨基酸分离的影响(表1)。

表1 缓冲液离子浓度

各组分的分离度和保留时间随着缓冲液离子浓度的增加而增加，当缓冲液中硼砂的离子浓度为60 mmol/L，磷酸氢二钾的浓度为20 mmol/L时，分离时间相对较短、各氨基酸的峰形和分离度也相对较好(图1)。

A～E分别对应表1中第1组到第5组实验的毛细管电泳结果

图1缓冲液离子浓度对氨基酸分离的影响

Figure 1 The results of the mixed amino acids separated by different ion concentrations of the buffer

2.1.2 缓冲液pH值

考察了pH 8、9、10、11和12的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氢二钾(20 mmol/L) 缓冲溶液对氨基酸分离的影响，发现随着缓冲液中pH值的增大，各标准氨基酸的保留时间和分离度也随之增大，当pH 为11 时分离时间相对较短，12种氨基酸7个可基线分离，另5个接近基线分离(图2)。

2.1.3 分离电压

采用pH 11硼砂(60 mmol/L)-磷酸氢二钾(20 mmol/L)缓冲溶液，考察了分离电压为3、5、10、15和20 kV时的分离情况。结果表明，当分离电压为10 kV 时12种混合氨基酸可实现较好的分离(图3)。

A～E分别为pH 8、9、10、11和12的缓冲液电泳结果

图2缓冲液pH值对氨基酸分离的影响

Figure 2 The results of the mixed amino acids separated by different pH values of buffer

A～E分别表示分离电压为3、5、10、15和20 kV时的分离图谱

图3分离电压对氨基酸分离的影响

Figure 3 The results of the mixed amino acids separated by different separation voltages

2.1.4 毛细管有效长度

考察了有效长度分别为35、45、55、65和75 cm时的分离效果。结果表明，随着毛细管有效长度的增加，混合氨基酸各组分的保留时间相应增加。当毛细管有效长度为55 cm的时候，在保证较好的分离度情况下，分离时间较短(图4)。

2.1.5 分离条件的确定

综合上述优化实验结果，异硫氰酸苯脂衍生化的12种混合氨基酸最佳分离条件为：pH 11的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氢二钾(20 mmol/L)缓冲溶液，分离电压10 kV、毛细管有效长度55 cm，在此条件下12种游离氨基酸的全部实现基线分离(图5，表2)。

A～E分别表示毛细管有效长度为35、45、55、65和75 cm时的图谱

图4毛细管有效长度对氨基酸分离的影响

Figure 4 The results of the mixed amino acids separated by different effective length of capillary

表2 12种游离氨基酸分离度

2.2 标准曲线的测定及方法学考察

2.2.1 标准曲线及其方法学考察结果

精密量取1.2.1配制的12种氨基酸对照品溶液，用蒸馏水依次稀释成不同的浓度，在优化的电泳条件下依次进行测定，以峰面积(Y)对各标准品的质量浓度X(mg/mL)绘制标准曲线，分析各标准氨基酸的检测限(LOD)、定量限(LOQ)以及线性范围(表3)。

2.2.2 精密度

取一定量1.2.1所述方法配制的12种氨基酸对照品溶液，在优化的电泳条件下，日内、日间分别连续进样 3 次，记录各物质对应的迁移时间和峰面积，以此求得对应的精密度，得到日内精密度RSD≤3.1%，日间精密度RSD≤4.6%，说明构建的方法精密度良好。

2.2.3 实际样品分析

1)定性分析

按1.2.3中2)所述方法制备的石斛样品，在优化的最佳电泳条件下测定，测得霍山石斛根、茎、叶总游离氨基酸提取物HPCE图谱(图6)。

1:精氨酸(Arg); 2:赖氨酸(Lys); 3:色氨酸 (Trp); 4:苯丙氨酸(Phe); 5:异亮氨酸(Ile); 6:亮氨酸(Leu); 7:组氨酸(His); 8:脯氨酸(Pro); 9:苏氨酸(Thr); 10:丝氨酸(Ser); 11:丙氨酸(Ala); 12:甘氨酸(Gly)

图5最优分离条件下HPCE图谱

Figure 5 The HPCE map of the 12 amino acids analyzed in the optimal separating conditions

通过与氨基酸标准品对比保留时间及内标，共从霍山石斛根茎叶总游离氨基酸中鉴定出12种游离氨基酸(表5)。

A～C分别表示霍山石斛茎、叶、根总游离氨基酸HPCE图谱

图6霍山石斛茎、叶、根总游离氨基高效毛细管电泳色谱图

Figure 6 The HPCE chromatography of the total free amino acids from the stem, leaf and root ofD.huoshanense

表3 12种氨基酸的回归方程及其相关系数、线性范围、检测限与定量限

2)定量分析

按1.2.3中2)制备的石斛样品，在优化的最佳电泳条件下测定，根据标准曲线，计算出各氨基酸在霍山石斛样品中的含量(表4)。所测霍山石斛样品中，叶中的总游离氨基酸含量最高，根中最低。霍山石斛根中精氨酸含量最高，茎中甘氨酸含量最高，叶中异亮氨酸含量最高。

表4 霍山石斛根、茎、叶游离氨基酸含量测定结果

2.3 加样回收实验

取氨基酸标准品，按表4所示含量，精密称定，加入0.5 g的霍山石斛样品中，根据1.2.3中2)方法所述，制备加样回收所需供试品溶液，并按照最佳毛细管电泳方法进行测定，计算回收率。结果表明(表5)，各氨基酸加样回收率在90.17%～110.25%之间，RSD≤5%(n=3)。

表5 加样回收率(n=3)

3 结论

研究了异硫氰酸苯脂衍生化-毛细管电泳法同时测定霍山石斛中12 种游离氨基酸的方法。通过优化实验条件，确定霍山石斛游离氨基酸异硫氰酸苯脂衍生化-毛细管电泳分离条件为：检测波长254 nm，毛细管有效长度55 cm，pH 11的硼砂 (60 mmol/L) -磷酸氢二钾 (20 mmol/L) 缓冲溶液，分离电压10 kV。在该条件下，12种游离氨基酸可在60 min内实现基线分离，各氨基酸线性相关系数R2的数值均大于0.99，日内精密度RSD≤3.1%，日间精密度RSD≤4.6%，加样回收率在91.2% ～110.25%，RSD均小于5%(n=3)。该方法操作简便，检测成本低，重现性较好，可用于霍山石斛中游离氨基酸的分析检测。